miR-124通過靶基因IQGAP1調控甲狀腺癌細胞分化、增殖的機制

于 佳 何 慶 劉玲梅 李宇琛

(天津市海河醫院內科，天津 300350)

miR-124通過靶基因IQGAP1調控甲狀腺癌細胞分化、增殖的機制

于 佳 何 慶1劉玲梅 李宇琛

(天津市海河醫院內科，天津 300350)

目的 探討miR-124對甲狀腺癌細胞的作用機制。方法 通過RT-PCR檢測人甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1中miR-124的表達水平。MTT法檢測甲狀腺癌細胞K1轉染miR-124 mimics、mimics control后的細胞存活率。根據靶基因預測軟件The miRBase、TargetScan、PicTar預測miR-124的靶基因IQGAP1，構建wt-IQGAP1和mut-IQGAP1，采用雙熒光素酶活性檢測鑒定靶基因的正確性。Western印跡檢測轉染miR-124 mimics、mimics control后甲狀腺癌細胞K1中IQGAP1的表達情況。甲狀腺癌細胞K1中轉染siIQGAP1和siIQGAP1 control，用MTT檢測細胞增殖能力，Western印跡檢測細胞中IQGAP1蛋白表達含量。結果 甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1中的miR-124的相對表達量與甲狀腺細胞相比差異顯著(P<0.05)，三種甲狀腺癌細胞中K1細胞的表達量最低。轉染后12 h內，空白組、miR-124 mimics組和mimics control組的甲狀腺癌K1細胞的存活數量差異不顯著(P>0.05)，從轉染后12 h開始，miR-124 mimics組與對照組、mimics control組相比，甲狀腺癌細胞生長抑制明顯。預測miR-124的靶基因可能為IQGAP1，轉染miR-124 mimics 野生型IQGAP1中熒光素酶活性比突變型IQGAP1中熒光素酶活性顯著降低，差異顯著(P<0.05)。mimics control和wt-IQGAP1和mut-IQGAP1共轉染組比較無明顯差異(P>0.05)。轉染miR-124 mimics組甲狀腺癌K1細胞IQGAP1蛋白明顯下降，miR-124負調控IQGAP1的表達。抑制甲狀腺癌K1細胞中IQGAP1基因，細胞增殖能力減弱，細胞中IQGAP1蛋白表達減弱。結論 miR-124在甲狀腺癌細胞中表達下調，miR-124可以抑制甲狀腺癌細胞的增殖分化，其通過負調控靶基因IQGAP1抑制癌細胞增殖分化。

甲狀腺癌；miRNA；靶基因；增殖

甲狀腺癌發病率高，致死率高，治療預后差〔1〕，因此，尋找治療和診斷甲狀腺癌的小分子標志物對于提高甲狀腺癌的診斷率和治療效果都具有重要意義。miRNA是一種小分子的RNA，由20～25個核苷酸組成〔2〕。生物機體內存在多種小RNA分子，這些小分子是非編碼性的單鏈RNA，具有多種生物學功能。近年來，小RNA分子與腫瘤的關系受到廣泛關注，在胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴癌等多種腫瘤中已經得到驗證〔3〕。miR-124在乳腺癌、胃癌中表達下調〔4〕，但關于miR-124在甲狀腺癌中的表達研究尚未見相關報道。本研究通過對比多種甲狀腺癌細胞中miR-124表達水平，研究miR-124對甲狀腺癌細胞增殖的影響，探討miR-124對相關靶基因的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1均為本實驗室保存。主要儀器與試劑：酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)，紫外分光光度計(美國Thermo)，CO2培養箱(日本SANYO)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，水浴鍋(上海精密儀器儀表公司)，離心機(湖南恒諾醫用設備有限公司)，熒光素酶檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕，DMEM培養基(美國Sigma)，DAB顯色液(美國Thermo)，Triozl細胞裂解液(美國Thermo)，抗體稀釋液(杭州聯科生物股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，MTT(碧云天生物技術有限公司)，青鏈霉素(美國Sigma)，PBS(碧云天生物技術有限公司)，胰蛋白酶(美國Sigma)，脫脂奶粉(雅培)，細胞總蛋白提取(碧云天生物技術有限公司)，Real-time PCR試劑盒(上海欣百諾生物工程有限公司)，兔抗IQGAP1多克隆抗體(北京博爾邁生物技術有限公司)，鼠抗人β-actin抗體(北京博爾邁生物技術有限公司)，辣根過氧化物標記的二抗(北京博爾邁生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 從液氮罐中取出人甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，放置于37℃水浴鍋中融化，觀察細胞完全融化后，加入8倍體積的細胞生長液(含青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml，15%FBS的DMEM培養基，pH7.2)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入細胞生長液，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。觀察細胞生長液顏色變淺時，加入0.5%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min，棄去胰蛋白酶消化液，加入新鮮的細胞生長液懸浮細胞，接種于細胞培養瓶中培養。

1.2.2 RT-PCR檢測細胞中miR-124表達 取對數生長期的人甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，加入適量Triozl細胞裂解液，放置于冰上靜置5 min，用移液槍吹打細胞。將裂解的細胞轉移至1.5 ml EP管中，加入200 μl氯仿充分混勻，上下顛倒10次，室溫靜置3 min。4℃12 000 r/min離心15 min，吸取水相層至新的EP管中，加入異丙醇500 μl混合均勻，室溫下靜置20 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入75%的乙醇充分混合，10 000 r/min離心5 min，棄上清，放置于超凈工作臺中晾干，加入DEPC水，-80℃保存。用紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成各組細胞miR-124的cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒操作說明書擴增miR-124的cDNA，分析各組細胞中miR-124表達水平。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期的甲狀腺癌細胞K1，加入胰蛋白酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，調整細胞濃度為每毫升含有5×103個細胞，37℃、CO2培養箱中培養過夜，觀察細胞融合度大約為80%后，將細胞生長液換成不含血清的DMEM不完全培養基繼續孵育1 h以增加轉染效率。將5 μl轉染試劑Lipofectamine 2000與250 μl的不完全培養基混合均勻后，室溫下靜置5 min，同時取250 μl的不完全培養基與miR-124 mimics、mimics control混合室溫靜置5 min。將Lipofectamine 2000混合物加入到miR-124 mimics、mimics control混合物中，室溫靜置20 min。將混合物加入到細胞中，37℃、CO2培養箱中培養6 h，換含有胎牛血清的完全培養液繼續培養。

1.2.4 MTT法檢測轉染細胞增殖情況 轉染miR-124 mimics、mimics control后的K1細胞接種于96孔細胞培養板中，同時設置空白對照組，空白對照組用未轉染的甲狀腺癌細胞K1，細胞濃度為3×105個/ml，每孔加入100 μl細胞懸液，37℃、CO2培養箱中培養24 h后，加入50 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，37℃孵育4 h。小心棄去上清，加入150 μl DMSO溶液混合，搖床震蕩10 min，觀察結晶物充分溶解后，放置于酶標儀上檢測各孔吸光度，為了提高實驗結果的準確性，每組設置8個復孔。觀察細胞存活情況。

1.2.5 miR-124靶基因預測與鑒定 根據靶基因預測軟件The miRBase(http://www.mirbase.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)預測miR-124的靶基因，結果顯示IQGAP1可能是miR-124的靶基因。分別構建野生型IQGAP1熒光素酶報告基因載體(wt-IQGAP1)和突變型IQGAP1熒光素酶報告基因載體(mut-IQGAP1)，將這兩種質粒wt-IQGAP1和mut-IQGAP1分別與miR-124 mimics和mimics control混合后共同轉染到甲狀腺癌K1細胞中，37℃、CO2培養箱中培養48h。收集的細胞經PBS洗滌后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Western印跡檢測IQGAP1的表達 轉染miR-124 mimics、mimics control后的甲狀腺癌K1細胞培養24 h后，收集細胞并加入冰預冷的PBS反復洗滌細胞3次，胰蛋白酶消化細胞后，10 000 r/min離心5 min，加入適量PBS懸浮細胞，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復洗滌細胞2次。加入細胞蛋白提取液充分混合，放置于冰上孵育20 min，振蕩器上震蕩10 min。吸取裂解細胞轉移至離心管中，1 000 r/min離心10 min，取蛋白上清置于-20℃冰箱中保存備用。紫外分光光度計測定蛋白濃度及純度，取蛋白樣品與loading buffer混合，100℃煮沸變性5 min。SDS蛋白膠用12%分離膠和5%濃縮膠，80 V電壓電泳觀察溴酚藍進入濃縮膠和分離膠交界處，調整電壓為120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠置于電泳緩沖液中浸泡20 min，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙的順序在300 mA轉膜90 min。取出PVDF膜加5%脫脂奶粉的封閉液在37℃封閉2 h，PBST洗滌PVDF膜，加入一抗，室溫下孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，加二抗孵育過夜。PBST洗膜，加入DAB顯色液，暗室中曝光，用凝膠光密度軟件分析蛋白表達含量。

1.2.7 IQGAP1對細胞增殖影響 將處于對數生長期的甲狀腺癌細胞K1轉染siIQGAP1和 siIQGAP1 control，MTT法檢測細胞增殖情況，轉染方法同1.2.3，MTT法檢測細胞增殖同1.2.4。Western印跡檢測轉染siIQGAP1和 siIQGAP1 control后的甲狀腺癌細胞中IQGAP1 的表達水平，方法同1.2.6。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1 各組細胞中miR-124的表達檢測 甲狀腺癌細胞K1中miR-124相對表達量為(1.14±0.11)，BCPAP中為(3.24±0.21)，TPC-1中為(2.31±0.16)，Nthy-ori 3-1中為(3.98±0.24)。甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1中的miR-124的相對表達量與甲狀腺細胞相比差異顯著(P<0.05)，三種甲狀腺癌細胞中K1細胞的表達量最低。

2.2 MTT法檢測細胞增殖情況 轉染后12 h內，空白組、miR-124 mimics組和mimics control組的甲狀腺癌K1細胞的OD值差異不顯著(P<0.05)。從轉染后12 h開始，miR-124 mimics組與空白組、mimics control組相比，細胞生長抑制明顯(見圖1)。從轉染后48 h開始，miR-124 mimics組與空白組、mimics control組相比細胞吸光度差異顯著(P<0.05)，miR-124可以明顯抑制甲狀腺癌細胞K1的增殖。

與空白組比較：1)P<0.05 圖1 MTT法檢測miR-124對甲狀腺癌細胞K1的存活影響

2.3 miR-124靶基因鑒定 轉染miR-124 mimics 野生型IQGAP1中熒光素酶活性比突變型IQGAP1中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。mimics control與wt-IQGAP1和mut-IQGAP1共轉染組無明顯差異(P>0.05)，說明miR-124的靶基因為IQGAP1。

2.4 Western印跡檢測IQGAP1蛋白表達含量 將轉染有miR-124 mimics的甲狀腺癌K1細胞中IQGAP1蛋白表達含量與空白組和mimics control組相比差異顯著(P<0.01)。空白組和mimics control組的IQGAP1蛋白表達含量差異不顯著(P>0.05)。miR-124 mimics組甲狀腺癌K1細胞IQGAP1蛋白明顯下降(圖2)，說明miR-124 mimics可以有效抑制IQGAP1蛋白的表達，miR-124負調控IQGAP1的表達。

1：miR-124 mimics;2:mimics control;3:空白組圖2 Western印跡檢測IQGAP1蛋白表達情況

2.5 IQGAP1對甲狀腺癌細胞影響 轉染siIQGAP1后的甲狀腺癌細胞K1與對照組相比增殖能力明顯減弱(P<0.05)。提示siIQGAP1可以明顯減弱細胞中IQGAP1蛋白的表達量。見圖3。

圖3 IQGAP1對甲狀腺癌細胞的影響

3 討 論

甲狀腺癌早期臨床癥狀不明顯且不易察覺，目前治療甲狀腺癌的方法主要有非手術治療和手術治療，非手術治療可以有效緩解癥狀，延長生存率，主要應用于晚期腫瘤不能完全切除的患者；手術治療一般適用于早期診斷為甲狀腺瘤的患者，對患者的身體狀況要求較高〔5〕。傳統的診斷和治療方法具有很大的局限性，給甲狀腺腫瘤早期診斷和治療帶來了巨大挑戰。甲狀腺癌的發生和發展受多種基因、多種信號因子的調控〔6〕，尋找診斷和治療甲狀腺癌的小分子標志物是目前迫切需要解決的問題。

miRNA是一種小分子的RNA，在機體中具有調控功能，有研究發現，miRNA可以調控細胞的生長和凋亡，與胰島素的分泌、大腦形態形成都有密切關系〔7〕。近年來，miRNA與腫瘤之間的關系也得到廣泛關注，有研究發現miRNA具有抑癌基因和癌基因的作用〔8〕。研究表明，miR-125b與乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌有密切關系，在癌癥的發生過程中起到抑癌基因的作用。miR-15a和miR-16-1在淋巴瘤和骨髓瘤中低表達，通過上調Bcl-2的表達促進癌癥的發生。miR-21在膠質母細胞瘤中過度表達，表達水平是正常組織的100倍，可以通過抑制癌細胞凋亡促進腫瘤的發生。miR-17-5p、miR-18a、miR-19b等都是目前為止在淋巴瘤中得到驗證的癌基因〔9〕。

miR-124已經被發現在乳腺癌、肝癌、胃癌細胞和組織中低表達，為一種抑癌基因。為了探究miR-124在甲狀腺癌中的作用機制，本研究選用了人甲狀腺癌細胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，通過細胞RNA提取，反轉錄合成miR-124的cDNA，RT-PCR檢測細胞中miR-124的表達水平。結果提示，miR-124在人甲狀腺癌細胞中的表達水平明顯低于人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，說明miR-124在甲狀腺癌細胞中低表達，發揮抑癌基因的作用。轉染miR-124 mimics、mimics control

的甲狀腺癌K1細胞經MTT法檢測，miR-124mimics可以明顯抑制甲狀腺癌K1細胞的增殖，進一步驗證了miR-124的抑癌作用。

miRNA主要通過作用于靶基因發揮抑癌或癌基因的作用。有研究表明miR-221可以作用于靶基因BRAF發揮作用。miR-21作用于靶基因PNTE，下調PNTE的表達，而PNTE與信號通路PIK/AKT有關。miR-124在肝癌細胞中干擾STAT3信號通路發揮抑癌基因作用，在胃癌中，miR-124可以下調靶基因EZH2的表達，在乳腺癌細胞中，miR-124作用于靶基因FLOT1影響癌細胞的增殖和侵襲力〔10〕。

IQGAP1是一種支架蛋白，為IQGAPs家族的一員。IQGAP1含有能與多種蛋白相結合的區域，可以與Rac1、ERK、Src等多種蛋白相結合作用于信號通路MAPK和Wnt。在肝癌中，IQGAP1過表達可以活化Wnt信號通路，促進肝癌的發生和發展，IQGAP1在乳腺癌中高表達，促進乳腺癌細胞增殖分化〔11〕。本研究通過轉染miR-124 mimics、mimics control，Western blot 檢測細胞中IQGAP1的表達水平，與空白組相比IQGAP1表達明顯下降，說明IQGAP1是一種癌基因，miR-124 mimics可以有效降低IQGAP1的表達。通過抑制IQGAP1基因，可使甲狀腺癌細胞增殖能力明顯減弱，說明miR-124可通過作用于IQGAP1基因抑制甲狀腺癌細胞增殖。

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〔2016-06-15修回〕

(編輯 郭 菁)

何 慶(1969-)，男，博士，主任醫師，主要從事糖尿病、甲狀腺等內分泌疾病研究。

于 佳(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事內分泌研究。

R73

A

1005-9202(2017)03-0566-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.018

1 天津市醫科大學總醫院內分泌科