Galectin-8蛋白對組織工程心臟瓣膜種子細胞的增殖、黏附功能的影響

林 彬 馮德廣

(河南省人民醫院，河南 鄭州 450003)

Galectin-8蛋白對組織工程心臟瓣膜種子細胞的增殖、黏附功能的影響

林 彬 馮德廣

(河南省人民醫院，河南 鄭州 450003)

目的 體外研究Galectin-8在不同濃度或狀態下對組織工程心臟瓣膜種子細胞增殖及黏附的影響。方法 以骨髓間充質干細胞分化而來的內皮細胞作為種子細胞，離體狀態下常規培養。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定不同濃度下Galectin-8作用12、24、48 h后對細胞增殖的影響；將細胞分為重組質粒pGFP-Galectin-8轉染組、空質粒pGFP轉染組、陰性對照組及蛋白預鋪組，分別鋪于96孔板中，觀察相同時間段的細胞黏附數量。結果 Galectin-8 10、20、40 μg/ml劑量組的細胞增殖數目均顯著高于空白對照組，其中20 μg/ml組表現尤為顯著(P<0.05)；pGFP-Galectin-8轉染組的轉染效率與空質粒pGFP轉染組無顯著差異(P>0.05)，且Galectin-8的表達量顯著高于空質粒pGFP轉染組和陰性對照組(P<0.05)；細胞種植到培養板上1、2、4 h后，蛋白預鋪組相同時間的細胞黏附數量顯著高于其他各組(P<0.05)，pGFP-Galectin-8轉染組的細胞黏附數量顯著小于其他各組(P<0.05)，空質粒pGFP轉染組和陰性對照組的細胞黏附數量無顯著差異(P>0.05)。結論 Galectin-8對內皮細胞的增殖具有促進作用，且在細胞種植前預鋪蛋白固定后能夠顯著增加內皮細胞的黏附，而胞內Galectin-8過表達則抑制細胞黏附。

Galectin-8；組織工程心臟瓣膜；種子細胞；增殖；黏附

組織工程心臟瓣膜是一種理想的人造心臟瓣膜，在治療心臟瓣膜性疾病過程中能夠克服機械瓣膜和生物瓣膜的缺點，有望實現抗凝、耐受且對生長發育無副作用〔1〕。組織工程心臟瓣膜的研究重點分為種子細胞、支架材料及瓣膜構建三個方面，目前有關種子細胞和支架材料的研究已比較成熟，而關于瓣膜構建仍處于摸索階段，尤其是如何將種子細胞最大效率地種植在支架上，提高其增殖速度和黏附性成為目前該項目的研究關鍵〔2〕。Galectin-8蛋白屬于β-半乳糖凝集素家族，是一種分泌蛋白，主要通過與整合素結合，活化相關細胞通路，調控細胞黏連，在細胞黏附中發揮重要作用，但研究表明Galectin-8蛋白在細胞黏附中具有雙重作用〔3，4〕。本研究通過不同濃度不同處理方式研究Galectin-8蛋白對種子細胞增殖及黏附的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗資料及主要試劑 種子細胞血管內皮細胞由骨髓間充質干細胞誘導分化并凍存；Galectin-8蛋白購自sino生物科技公司；pGFP-Galectin-8表達質粒由上海生工生物有限公司構建。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和胰蛋白酶購自Sigma公司，Dulbecco極限必需培養基達爾伯克漢良伊格爾培養基(DMEM)及胎牛血清均購自GIBCO公司，Lipofectamine?2000購自Invitrogen公司，兔抗人Galectin-8一抗及羊抗兔二抗均購自Abcam公司。

1.2 細胞復蘇及培養 凍存的血管內細胞作為組織工程心臟瓣膜種子細胞，37℃水浴中快速融化，加含10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋，1 000 r/min，離心5 min，吸棄培養基，再用3 ml新鮮培養基重懸細胞并吸入培養瓶中，置于5% CO2、37℃培養箱中進行培養。

1.3 細胞增殖實驗 內皮細胞傳至3～4代后，待細胞生長至瓶底的90%時，0.25%胰蛋白酶消化處理，細胞計數后調細胞量至5×104/ml，接種于96孔細胞培養板中，每組6個復孔，每孔200 μl，置于CO2培養中培養24 h，吸棄培養基更換為含不同濃度Galectin-8(5、10、20、40 μg/ml)的細胞培養液，以不含蛋白的培養基作為空白對照，放于培養箱中培養，于培養12、24、48 h后測定細胞量，每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)繼續培養4 h，棄上清加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，于酶標儀下測定OD490 nm的吸光值。

1.4 黏附實驗

1.4.1 將細胞進行分組處理 ①將重組質粒pGFP-Galectin-8按照Lipofectamine?2000操作說明轉染至提前鋪于6孔板的細胞中，細胞初密度為1.5×105/孔，并于轉染后24 h在顯微鏡下觀察轉染效率，收集細胞，提取蛋白，Western印跡法檢測蛋白表達水平，使用Image J進行條帶分析。②將不含Galectin-8基因的空質粒載體pGFP轉染細胞，操作方法同上。③細胞不做任何處理，在相同時間收集細胞，作為陰性對照。④在細胞鋪板前，將增殖實驗中濃度最佳的Galectin-8蛋白預鋪至96孔板中為蛋白預鋪組，并于4℃風干16 h，磷酸緩沖液(PBS)沖洗。

1.4.2 黏附性測定 將處理或轉染后的細胞按照5×104/孔的細胞密度鋪于96孔板中，培養基不含血清，每組重復3次，放于CO2培養箱中培養，在培養1、2、4 h后分別取出培養板吸棄培養液，加100 μl甲醇，固定15 min，蒸餾水沖洗后晾干，采用100 μl吉姆薩進行15 min染色，并在室溫風干，于顯微鏡下進行細胞計數，每孔取3個不同的視野進行計數最終取平均值作為黏附細胞數量。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 Galectin-8對細胞增殖的影響 當Galectin-8處理細胞12 h時，各組細胞量無顯著差異，作用24 h后，Galectin-8處理組的細胞數量高于對照組，其中Galectin-8 10、20、40 μg/ml濃度的細胞量與空白對照組差異顯著(P<0.05)，作用時間延長至48 h，細胞密度較24 h均有上升，其中Galectin-8 20 μg/ml組的細胞密度顯著大于其他各組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組內皮細胞轉染情況 轉染后24 h pGFP-Galectin-8轉染組的轉染效率為57.03%，空質粒pGFP轉染組56.50%，兩組無顯著差異，陰性對照組未做任何處理，在同樣曝光強度和曝光時間下，無熒光出現。見圖1。

2.3 各組內皮細胞中Galectin-8蛋白表達情況 pGFP-Galectin-8轉染組Galectin-8的表達(1.15±0.02)顯著高于空質粒pGFP組(0.08±0.01)和陰性對照組(0.03±0.01)(P<0.05)。見圖2。

表1 Galectin-8對細胞增殖的影響

與空白對照組比較:1)P<0.05；與其他各組比較：2)P<0.05

圖1 各組轉染效率比較(×200)

1.pGFP-Galectin-8轉染組；2.空質粒pGFP轉染組；3.陰性對照組圖2 Galectin-8蛋白表達情況

2.4 Galectin-8對細胞黏附的影響 蛋白預鋪組細胞黏附個數最多，在不同時間段均顯著高于其他各組(P<0.05)，且隨著時間的增長不斷增多，pGFP-Galectin-8轉染組細胞黏附數目最少，顯著低于其他3組，陰性對照組與空質粒pGFP轉染組無統計學差異。見表2。

表2 Galectin-8對細胞黏附的影響，個,n=9)

與pGFP-Galectin-8轉染組比較：1)P<0.05；與空質粒pGFP轉染組比較：2)P<0.05；與陰性對照組比較：3)P<0.05

3 討 論

心臟瓣膜病、先天性心臟病嚴重危害人類健康，其治療是心外科領域的重點、難點。組織工程心臟瓣膜由于其優良的血流動力學性能，不需抗凝，不僅應用于主動脈瓣和肺動脈瓣的置換，同時還是復雜先天性心臟病糾治中帶瓣管道良好的替代材料。獲得種子細胞是組織工程的前提基礎，目前篩選得到符合條件的種子細胞主要包括間質細胞、血管內皮細胞及干細胞等，但血管內皮細胞主要來源于用動脈或靜脈，在取材時具有一定創傷性，間質細胞主要為肌纖維細胞，其功能與正常瓣膜細胞具有一定差距〔5，6〕。骨髓間充質干細胞是一種多能干細胞，獲取方便，體外培養、純化、擴增的技術也較為成熟，能夠誘導轉化為血管內皮細胞，已成為制備種子細胞的理想材料〔7〕。

在瓣膜構建過程中種子細胞與支架材料相互作用是一個極其復雜的過程，如何促進種子細胞在支架材料上的增殖、黏附及延長其在瓣膜表面的壽命成為目前研究的關鍵〔8〕。Galectin-8屬于凝集素亞家族，包含兩個碳水化合物識別區，主要分為原始型、串聯重復型和嵌合體型三種類型。研究表明，Galectin-8可以促進脾細胞的增殖，低劑量的Galectin-8可以促進T細胞的增殖，在炎癥反應中發揮重要作用〔9〕。另有研究發現，當Galectin-8濃度過高時會引起胞內鈣離子和磷酯酰絲氨酸增多，刺激caspase-3的表達促進上皮細胞凋亡〔10〕。本研究在探討Galectin-8對細胞增殖影響時，同樣發現其在一定濃度范圍內促進內皮細胞生長，當過高時反而導致細胞數量下降，與上述觀點一致。種子細胞與支架材料之間的黏附主要是細胞與基質間的黏附，即在黏附因子介導下細胞表面受體與胞外配體結合，再與基質相互作用引起細胞與基質的黏附〔11〕。黏附因子主要包括整合素家族、鈣黏素、免疫球蛋白超家族、選擇素家族及透明質酸黏素五類。整合素是一種跨膜蛋白，在與配體結合活化后，可以通過α-肌動蛋白、裸蛋白及黏著斑蛋白等與細胞骨架連接，形成配體-整合素-細胞骨架系統，促進細胞黏附〔12〕。據報道，Galectin-8蛋白作為細胞內的活化因子，能夠增加整合素與配體的結合，活化細胞內的信號通路，進而促進黏著斑激酶FAK磷酸化，小GTP酶的激活及結合蛋白的恢復等，最終增強細胞與基質蛋白的黏附〔13〕。但Galectin-8蛋白對整合素的調控具有雙重作用，Troncoso等〔14〕研究顯示當Galectin-8蛋白過量分泌時，導致其與細胞表面的整合素大量結合，負調節細胞與胞外基質間的黏附。熊輝強等〔15〕研究表明Galectin-8在組織分化差惡性程度高的喉鱗狀上皮細胞癌中高表達，參與癌細胞的黏附侵襲。本研究表明過量的Galectin-8能夠占據細胞表面的整合素結合位點，進而降低細胞黏附活性，而將Galectin-8預先包被在載體上，再種植細胞時能夠顯著增加細胞的黏附活性。

綜上，Galectin-8蛋白在一定濃度范圍內能夠促進血管內皮細胞增殖，血管內皮細胞轉染Galectin-8表達質粒時會導致溶解性蛋白過量進而抑制細胞與基質的黏附，而將Galectin-8蛋白在種植細胞前預鋪于載體上能促進細胞黏附。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

林 彬(1982-)，男，主治醫師，碩士，主要從事心臟基礎及臨床研究。

R654.2

A

1005-9202(2017)03-0573-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.021