滇桂艾納香多糖的分離純化及單糖組成分析

許子競(jìng)，劉 茜，舒群威，張志紅

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院天然產(chǎn)物中心，中國(guó) 畢節(jié) 551700；2.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，中國(guó) 梧州 543000)

滇桂艾納香多糖的分離純化及單糖組成分析

許子競(jìng)1，劉 茜2，舒群威1，張志紅1

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院天然產(chǎn)物中心，中國(guó) 畢節(jié) 551700；2.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，中國(guó) 梧州 543000)

以滇桂艾納香干燥全草為原料，以水為溶劑提取多糖BRP，經(jīng)過D101大孔樹脂脫色，DEAE-纖維素柱分離，依次用水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和BRP-4四個(gè)洗脫部分；將BRP-0，BRP-1.5采用Sevage法脫蛋白、活水透析和Sephadex G-15柱層析，再經(jīng)瓊脂糖Sepharose 6FF柱層析分離純化，得到BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4五個(gè)組份；GPC檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布及峰型，確定它們?yōu)榫唤M分多糖；HPLC分析結(jié)果顯示，BRP-0和BRP-1.5主要由鼠李糖、果糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

滇桂艾納香多糖；DEAE-纖維素分離；凝膠色譜純化；HPGPC檢測(cè)；單糖分析

滇桂艾納香(Blumeariparia(BL.) DC)為菊科艾納香屬植物的干燥全草，又名假東風(fēng)草，多見于云南和廣西交接部，生于山草坡地或灌木叢中[1]，其味甘、溫、無(wú)毒，具有活血散瘀、祛風(fēng)除濕、利水作用，在廣西民間有幾百年的藥用歷史，常用于婦女經(jīng)期提前、產(chǎn)后血崩、浮腫、骨痛、受涼腹痛、腹瀉等多種婦科常見疾病的防治[2].以滇桂艾納香為原料的乙醇溶液提取物制成的中成藥——婦血康顆粒，已用于臨床，療效顯著；研究表明，其水提取物也具有顯著的止血活性功效[3-4]，但是其有效成分及其含量、藥理作用均不是非常明確；因此，本文對(duì)其水提多糖(BlumearipariaPolysaccharides,abbreviated as BRP)成分進(jìn)行提純，并對(duì)多糖的組分進(jìn)行分析[5-6]，為進(jìn)一步研究婦血康顆粒制劑的藥理和作用機(jī)制打下基礎(chǔ).

1 儀器與方法

1.1 材料與設(shè)備

滇桂艾納香干燥全草，廣西桂西制藥有限公司；DEAE-纖維素，上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-15和Sepharose 6FF 生化試劑，南京森貝伽生物科技公司；葡萄糖(AR),上海醫(yī)藥公司；果糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸(生化試劑),上海伯奧生物科技有限公司；RC-45-1k透析袋,上海綠島科技發(fā)展有公司；硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、丙酮等均為國(guó)產(chǎn)AR試劑.

Nexus 470型FT-IR紅外分光光譜儀(Nicole，America)；Agilent 1260高效液相色譜儀(America)；Agilent Technotgies 1200 GPC System(America);UV-265FW紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu Japan)；DZF60-20真空干燥箱(河南鞏義科技儀器公司)；ALPHAL-型真空冷凍干燥機(jī)(Germany).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滇桂艾納香干燥全草多糖BRP的提取、分離、純化

(1) 提取 取滇桂艾納香干燥全草5 kg，粉碎，過282 μm篩，稱其碎片3.0 kg，加無(wú)水乙醇回流提取多次，除去脂溶性成分，藥渣以蒸餾水為溶劑，用微波提取器(1 kW,10 L)在85 ℃下提取3次，每次20 min；提取液離心去雜、減壓濃縮約至原體積的1/5，加乙醇至含醇80%左右，冰浴放置過夜，離心，得BRP沉淀物.BRP用無(wú)水乙醇多次浸提，去除殘余脂溶性物質(zhì)和部分色素.

(2) 脫色 將上述BRP配成稀水溶液，直至沉淀物不再溶解，過濾，取濾液過D101大孔樹脂，用水洗脫，直至洗脫液顏色淺淡，收集水洗脫液，濃縮[7].

(3) 分離 將上述濃縮液進(jìn)行DEAE-纖維素柱層析[8-9]，依次用蒸餾水和0.15，0.30，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，用苯酚-硫酸顯色檢測(cè)，收集各梯度洗脫液.

(4) 脫蛋白 對(duì)各收集液采用Sevage法(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)多次脫蛋白至紫外260～280 nm處無(wú)明顯吸收峰為止[10].

(5) 透析 脫蛋白后的BRP溶液裝入G-RC-45-1k透析袋內(nèi)，活水透析72 h以上.

(6) 脫鹽 透析后的BRP溶液過Sephadex G-15柱層析，脫除BRP溶液中殘留的鹽，收集BRP溶液.

(7) 凝膠純化 將透析的BRP-0和BRP-1.5溶液濃縮，過0.45 μm微孔濾膜，經(jīng)瓊脂糖凝膠Sepharose 6FF層析，蒸餾水洗脫，自動(dòng)部分收集器收集，苯酚-硫酸顯色檢測(cè)，繪制洗脫曲線，根據(jù)峰型合并各洗脫部分，冷凍干燥，得BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4五個(gè)組分.

1.2.2 BRP性質(zhì)表征

(1) BRP相對(duì)分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布測(cè)定 采用凝膠滲透色譜法，Agilent 1260HPLC儀，柱型為PL.Aqnagel-OH(300 mm×7.8 mm)，柱溫，35 ℃；流動(dòng)相：0.05 mol/L H3PO4-Na2HPO4緩沖液(pH6.7，加0.05%NaN3)；流速:1.0 mL/min；示差折光檢測(cè)，進(jìn)樣體積20 μL；以T系列葡聚糖T-1，T-3，T-5，T-7，T-9，T-11和T-13為標(biāo)樣對(duì)照.

(2) BRP的酸水解 分別取50 mg BRP-0-1和BRP-1.5置于安培管中,加入6 mL 2 mol/L H2SO4，在油浴中保持110 ℃恒溫加熱8 h，水解液用BaCO3粉末中和除酸，離心，將上清液濃縮，定容至2 mL，供HPLC分析.

(3) BRP紅外光譜分析 取微量BRP樣品，拌KBr研磨壓片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描檢測(cè)基團(tuán)吸收峰類型.

(4) BRP單糖組成分析 色譜條件：Kromasil NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比為80∶20)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min，示差折光檢測(cè)；進(jìn)樣量：20 μL[11-12].

2 結(jié)果與分析

2.1 BRP蛋白含量檢測(cè)

BRP經(jīng)紫外光譜掃描檢測(cè),如圖1所示，260～280 nm處幾乎無(wú)紫外吸收峰，表明多糖中蛋白、多肽及核酸幾乎脫除完全，達(dá)到分離純化要求.

圖1 BRP脫蛋白前后紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of not removed protein (a) and removed protein (b) on BRP

2.2 DEAE-纖維素對(duì)BRP的分離

BRP溶液經(jīng)DEAE-纖維素層析柱分離，分別用蒸餾水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，收集部分分別命名BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和BRP-4.5，其洗脫曲線見圖2.由于BRP-3和BRP-4.5組分還含少量難除色素，所以只對(duì)BRP-0和BRP-1.5進(jìn)一步分離純化研究.

2.3 BRP-0進(jìn)一步純化

將BRP-0配成適當(dāng)濃度溶液，經(jīng)瓊脂糖凝膠Sepharose 6FF柱層析純化分離，蒸餾水洗脫，BRP-0的洗脫曲線如圖3所示，所得多糖命名BRP-0-1.

圖2 BRP在 DEAE-纖維素柱上的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of BRP on DEAE-cellulose column

圖3 BRP-0的Sepherose 6 FF層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of BRP-0 on Sepherose 6 FF column

2.4 BRP-1.5進(jìn)一步純化

將BRP-1.5上Sepharose 6 FF層析洗脫，得4個(gè)洗脫組分，分別命名為BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4，洗脫曲線如圖4所示.

2.5 BRP純化組分分子量及分子量分布測(cè)定

采用凝膠滲透色譜法(GPC 法)測(cè)定多糖BRP的相對(duì)分子質(zhì)量(M)[13]，BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4各組分分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布測(cè)定和純度如圖5～6所示.

圖4 BRP-1.5的Sepherose 6 FF層析洗脫曲線圖Fig.4 Elution curve of BRP-1.5 on Sepherose 6 FF column

圖5 多糖BRP-0-1的凝膠過濾色譜圖Fig.5 HPGPC of BRP-0-1

圖6 多糖BRP-1.5純化組分的凝膠過濾色譜圖Fig.6 HPGPC of BRP-1.5-1， BRP-1.5-2，BRP-1.5-3 and BRP-1.5-4

通過Agilent Technotgies 1200 GPC System檢測(cè)BRP色譜圖，得相對(duì)分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布參數(shù)如表1.

表1 BRP相對(duì)分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布參數(shù)

由表1可見，多糖組分BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系數(shù)分別為1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，這些組分均由單一色譜峰組成，峰型尖銳均勻?qū)ΨQ，表明它們是均一組分多糖.

2.6 BRP的紅外光譜圖

圖7 BRP的紅外光譜圖Fig.7 IR spectrum of BRP

基團(tuán)類型波數(shù)/cm-1峰的強(qiáng)度鍵的振動(dòng)類型O—H3418.83vsO—H伸縮振動(dòng)C—H2920.56,2847.66mC—H伸縮振動(dòng)C O1616.82sC O伸縮振動(dòng)C—H1423.36wδas(C—H)(CH3,—CH2)面內(nèi)彎曲振動(dòng)C—O1070.09vsC—O伸縮振動(dòng)

2.7 BRP-1.5的HPLC分析

HPLC對(duì)水解后的BRP多糖與單糖對(duì)照品對(duì)照，分析其單糖組成[15]，見圖8～9所示.結(jié)果表明，BRP-0和BRP-1.5除含少量半乳糖醛酸外，主要由鼠李糖、果糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

(1)半乳糖醛酸；(2)鼠李糖；(3)果糖；(4)半乳糖圖8 BRP-0-1的HPLC 檢測(cè)圖Fig.8 HPLC chromatogram of BRP-0-1

(1)半乳糖醛酸；(2)鼠李糖；(3)果糖；(4)半乳糖圖9 多糖BRP-1.5-3的HPLC色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of BRP-1.5-3

3 結(jié)論

滇桂艾納香干燥全草提取得粗多糖BRP，經(jīng)DEAE-纖維素層析分離得到BRP-0，BRP-1.5，BRP-3和 BRP-4.5，進(jìn)一步將BRP-0和BRP-1.5純化后獲得BRP-0-1，BRP-1.5-1，BRP-1.5-2，BRP-1.5-3和BRP-1.5-4組分，經(jīng)HPGPC檢測(cè)，它們?yōu)榫环肿佣嗵牵渲鼐鄬?duì)分子質(zhì)量分別為1 394，11 754，8 319，7 208和5 936，分散系數(shù)分別為1.035，1.053，1.099，1.091和1.081，說(shuō)明其分子質(zhì)量分布均一.通過HPLC分析，BRP-0和BRP-1.5主要由鼠李糖、果糖、半乳糖組成,其單糖物質(zhì)的量之比大致為：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584.

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(編輯 WJ)

Extraction,Purification and Composition Analysis of Polysaccharides fromBlumeaRiparia

XUZi-jing1,LIUQian2*,SHUQun-wei1,ZHANGZhi-hong1

(1.Center of Natural Products,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China；2.School of Chemical Engineering and Resource Recovery,Wuzhou University,Wuzhou 543002,China)

Polysaccharides BRP were extracted from dry grass ofBlumearipariaas raw materials with water as solvent.Four eluents,BRP-0,BRP-1.5,BRP-3 and BRP-4.5,were obtained from BRP by gradient elution with water,0.15 mol/L NaCl,0.3 mol/L NaCl,0.45 mol/L NaCl on DEAE-cellulose column after BRP being decolored on D101 macroporous resin column.BRP-0 and BRP-1.5 were deproteinized by using the Sevage method,and further purified by water dialysis and Sephadex G-15 chromatography to remove residual NaCl.Five portions of the elutent,BRP-0-1,BRP-1.5-1,BRP-1.5-2,BRP-1.5-3 and BRP-1.5-4.5,were obtained after the purification of BRP-0 and BRP-1.5 on agarose column chromatography Sepharose 6FF.Our results showed that they were homogeneous polysaccharides through GPC detection in molecular weight,molecular weight distribution,and GPC peak analysis.Our HPLC analysis results showed that both BRP-0 and BRP-1.5 mainly consisted of rhamnose,fructose,and galactose,whose molar mass ratios were about 1.00∶0.962∶0.392 and 1.00∶1.125∶0.584,respectively.

Polysaccharide fromBlumeariparia; DEAE-cellulose column separation; gel permeation chromatography purification; HPGPC detection; monosaccharide analysis

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.01.010

2016-09-01

貴州省科技廳、畢節(jié)市科技局學(xué)校聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(LH[2016]7059)；貴州省畢節(jié)市2016年科學(xué)發(fā)展計(jì)劃基金資助項(xiàng)目([2016]32)

* 通訊作者,E-mail：wzliuxi1975@126.com

R284

A

1000-2537(2017)01-0065-06