Salubrinal通過抗氧化應激延緩細胞衰老的實驗研究

李敏超 束婷婷 唐偉 婁青林 顧劉寶

Salubrinal通過抗氧化應激延緩細胞衰老的實驗研究

李敏超 束婷婷 唐偉 婁青林 顧劉寶

目的 觀察Salubrinal對Etoposide誘導的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)衰老的保護作用,并探討其可能的作用機制。 方法 將NRK-52E細胞株分為對照組、衰老組(Etoposide 1μg/ml誘導)及治療組(Etoposide 1μg/ml+Salubrinal 50 μmol/L),藥物干預24 h后于倒置顯微鏡下觀察各組NRK-52E細胞形態,β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色方法檢測細胞衰老情況,熒光素酶報告基因法檢測p16啟動子活性,DCFH法檢測ROS的水平, Western blot法檢測氧化應激標志性蛋白c-fos表達水平。 結果 與對照組相比,Etoposide刺激24 h后NRK-52E細胞衰老明顯增加,Salubrinal干預后NRK-52E細胞衰老形態改善;Etoposide刺激后活性氧(ROS)產生增多,p16啟動子活性增強,c-fos表達增加,Salubrinal干預后上述現象均被逆轉。 結論 Salubrinal可能通過抗氧化應激延緩Etoposide誘導的NRK-52E細胞衰老。

Salubrinal;衰老;氧化應激;保護

細胞衰老最初由Hayflick 在1961 年觀察到,指細胞由生長狀態轉變為不可逆的生長停止狀態[1]。細胞衰老是個體衰老在細胞水平的體現,常被用作衰老研究的實驗工具[2]。細胞衰老與個體衰老關系密切, 組織器官中衰老細胞的比例隨年齡上升而逐漸上升[3],細胞衰老可以通過多種途徑促進個體衰老及衰老相關性疾病[4],而清除衰老細胞能有效延緩衰老癥狀的出現[5]。因此,延緩細胞衰老對于整體抗衰老具有極為重要的意義和作用。

Salubrinal是一種小分子化合物,由Boyce等[6]在2005年首先報道。研究顯示,Salubrinal對細胞具有多方面的保護作用,可以對抗多種病理狀態誘發的細胞凋亡[7],能改善氧化應激[8],抑制 NF-κB 活性[9]。氧化應激是細胞衰老的促進因素,干細胞的DNA損傷常伴氧化應激,是干細胞衰老的問責因子[10]。同時氧化應激是衰老的主要驅動力之一,在衰老和衰老相關性疾病中可以發現過多的活性氧及其他氧化應激產物[11]。因此,本研究建立Etoposide誘導體外培養細胞衰老模型,予Salubrinal進行干預,探討Salubrinal通過抗氧化應激延緩細胞衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 Etoposide購自日本和光純藥工業株式會社,刺激濃度為1 μg/ml;Salubrinal 購自埃利斯維爾tocris生物科學,刺激濃度為50 μmol/L。DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司;胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、0.25%胰酶均購自于Gibco公司。活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天有限公司。p16INK4a-luc質粒由日本昭和大學Kiyoshi Nose教授惠贈。c-fos、β-actin和羊抗兔IgG等抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。ECL(Electro-Chemi-Luminescence)發光液和PVDF(Polyvinylidene fluoride)膜購于Millipore公司。

1.2 儀器 CO2恒溫培養箱(日本Sanyo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);低速離心機(美國Scilogex公司);PowerPacBasic電泳儀(美國Bio-Rad公司);熒光素酶分析系統(美國Promega公司)。

1.3 大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)培養及干預 NRK-52E細胞株由日本山梨大學Kitamura教授惠贈。NRK-52E細胞用5%胎牛血清的DMEM/F12培養基,在37 ℃、5% CO2培養箱內培養傳代,細胞生長匯合至80%時,棄原培養基,均勻加入0.25%胰酶1 ml,置于培養箱中消化約3 min,待貼壁細胞漂浮后,用5 ml培養基終止消化,吹打混勻制成單細胞懸液并轉移至15 ml離心管中,于低速離心機中1000 r/min離心4 min。吸去上清液,向細胞團塊中加入適量培養基,1/4～1/3傳代,每2～3 d傳代1次。取處于對數生長期的NRK-52E細胞,以2×105個/孔的密度鋪板至6孔板中,37 ℃、5% CO2培養24 h后,衰老組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激,治療組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激及濃度為50 μmol/L 的Salubrinal干預,干預后24 h觀察細胞形態及p16INK4a啟動子活性變化。

1.4 倒置顯微鏡觀察形態學變化 取處于對數生長期的NRK-52E細胞接種于6孔板,鋪板密度為2×105個/孔,37 ℃、5% CO2培養24 h后,分組給藥刺激,24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞衰老的形態學變化,并以倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司CK40-SL)拍攝細胞形態照片(200倍)。

1.5 SA-β-gal染色 實驗結束后收板以3% 福爾馬林固定細胞4 min,于X-gal溶液在37 ℃下培育6～24 h,倒置顯微鏡可見衰老細胞可經此法陽染而成為藍色。X-gal溶液組成:1 mg/ml X-gal,40 mmol/L pH 6.0的citric acid/sodium phosphate,5 mmol/L potassium ferricyanide, 5 mmol/L potassium ferrocyanide, 150 mmol/L氯化鈉和2 mmol/L氯化鎂。

1.6 ROS檢測 將NRK-52E細胞以1×105/孔的密度鋪板于12孔板中,37 ℃、5% CO2培養24 h后,給細胞換液,按6 h,1 h時間點給予藥物刺激,置于培養箱30 min后,用不含血清的培養液洗3遍,裝載探針,25 min后,再用不含血清的培養液洗3遍,置于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.7 細胞轉染及熒光素酶檢測 將NRK-52E細胞鋪于35 mm培養皿中,細胞數約2×105個,當生長融合接近80%時,將6 μl lipofectamine轉染試劑及3 μg pGL2-p16INK4a-luc質粒分別加入500 μl不含FBS的培養基中,吹打混勻后靜置5 min,然后將加入質粒及轉染試劑的液體混勻后靜置20 min,最后將上述混合液均勻滴入細胞中進行轉染,置于培養箱中6～8 h后換液,即得到轉染pGL2-p16INK4a質粒的細胞,于培養箱培養18～24 h后重新鋪板于96孔板,密度為2×104/孔,24 h后給予藥物刺激,衰老組予濃度為1 μg/mL的Etoposide刺激,治療組予濃度為1 μg/ml的Etoposide刺激及濃度為50 μmol/L的Salubrinal干預24 h后收板并檢測各組luciferase值,熒光素酶的活性通過熒光素酶分析系統根據制造商的方案進行評估,以CCK-8(Cell Counting Kit)結果校正細胞數量。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 吸去待收板細胞原培養液,PBS緩沖液洗2遍后加入裂解液,于冰上充分震蕩裂解,BSA(Bovine Serum Albumin)法測定蛋白濃度。取蛋白樣品各60 μg,在電泳槽中進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉膜至PVDF膜上,TBST(TBS+Tween)封閉1 h,一抗孵育過夜,其中c-fos抗體滴度1∶1000,β-actin 抗體滴度1∶2000。TBST洗膜5 min×3次,二抗孵育1.5 h,TBST再次洗膜5 min×3次,化學發光法成像。蛋白含量用Image J軟件進行半定量分析。

1.9 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件處理實驗數據,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用非參數Mann-Whitney U檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Salubrinal改善Etoposide誘導的NRK-52E細胞衰老形態學改變 對照組NRK-52E細胞形態正常,無特殊變化;Etoposide刺激NRK-52E細胞24 h后,形態發生改變,細胞體積變大,細胞扁平,胞核體積增加,多核,衰老形態細胞增加;Salubrinal干預后細胞衰老的形態改善,胞核體積減小,多核減少,衰老形態的細胞減少。見圖1。

2.2 SA-β-gal染色結果 光學顯微鏡下觀察,衰老形態的細胞SA-β-gal染色呈藍色。對照組著染陰性,Etoposide處理細胞24 h后SA-β-gal染色陽性細胞顯著增加,Salubrinal干預組SA-β-gal染色減弱,計算2組染色陽性率細胞,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 Salubrinal改善Etoposide誘導的NRK-52E細胞衰老形態學改變(×200)

2.3 Salubrinal抑制Etoposide誘導的p16INK4a轉錄激活 瞬時轉染p16INK4a質粒24 h后,用Etoposide及Salubrinal處理細胞,24 h后進行熒光素酶檢測以評價p16INK4a啟動子活性。結果顯示,Etoposide可誘導p16INK4a啟動子活性增強,Salubrinal干預后可部分逆轉p16INK4a啟動子活性的升高。見圖3。

圖3 Salubrinal抑制Etoposide誘導的p16INK4a活性

2.4 Salubrinal抑制Etoposide刺激后NRK-52E細胞ROS的產生 對照組NRK-52E細胞在裝載探針DCFH后僅能觀察到細胞本底水平的熒光;Etoposide刺激1 h,6 h后細胞熒光顯著增強,呈時間梯度增加;Salubrinal干預后熒光減弱,表明Salubrinal可以逆轉Etoposide誘導的NRK-52E 細胞ROS的升高。見圖4。

圖4 Salubrinal抑制Etoposide刺激后NRK-52E細胞ROS的產生

2.5 Salubrinal抑制Etoposide誘導的c-fos蛋白表達升高 與對照組相比,Etoposide處理后氧化應激蛋白c-fos表達蛋白明顯增加;Salubrinal干預后c-fos蛋白下調(1 h)。提示Salubrinal可抑制Etoposide誘導的氧化應激。見圖5。

圖5 Western blot檢測氧化應激標志性蛋白c-fos表達水平的影響

3 討論

本研究發現Salubrinal可以抑制Etoposide誘導的NRK-52E細胞衰老,緩解Etoposide對細胞造成的氧化應激,從而發揮對抗衰老的作用。目前對Salubrinal的生物學功能研究主要集中在其對抗細胞凋亡的研究,對其在改善細胞衰老方面的研究尚少。

本實驗采用Etoposide誘導細胞衰老,該方法是經典的衰老模型,倒置顯微鏡及SA-β-gal染色均可證實細胞衰老的發生。Salubrinal可明顯改善Etoposide誘導細胞衰老形態。除形態學的改善,Salubrinal還可抑制Etoposide誘導的pGL2-p16INK4a轉錄激活。Salubrinal同時改善Etoposide誘導的細胞氧化應激,包括逆轉Etoposide誘導的NRK-52E 細胞ROS的升高,抑制Etoposide誘導的c-fos蛋白表達升高。

研究表明,細胞衰老與氧化應激存在密切聯系,氧化應激通過損傷DNA使維持細胞基本生理功能的基因表達失活,從而導致細胞衰老[12],進而導致組織損傷。一方面,隨著年齡的增長,線粒體內的ROS 會不斷累積增加。過多的ROS會導致生物膜損傷、蛋白質損傷和mtDNA 氧化損傷,從而導致細胞衰老。另一方面,機體氧化與抗氧化水平失衡也是導致衰老的重要因素[13]。ROS和脂質過氧化反應的產物可以同時作用于基因組和線粒體DNA,導致各類DNA損傷:雙和單鏈斷裂,DNA加合物形成,DNA堿基和脫氧核糖改變。DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)是最危險的損害。他們造成嚴重的基因突變,導致各種疾病和腫瘤進展[14]。如果細胞修復及時的話，單鏈斷裂(single-strand breaks,SSBs)對細胞的有害性不大。如果修復不快,染色體的單鍵斷裂也會造成嚴重損害并導致許多疾病的發生[15]。

當機體處于氧化應激狀態時,體內組織細胞ROS 增加, 當超過機體清除能力時就會導致 ROS 蓄積。研究證實,ROS 能有效地激活 c-fos[16],因此,c-fos是反映氧化應激水平的重要因素。

綜上所述,Salubrinal可緩解Etoposide對ROS、c-fos等氧化應激分子的激活,因此其對抗衰老的可能作用機制之一為改善細胞的氧化應激狀態。Salubrinal發揮上述作用的更深層次機制包括端粒酶,其他衰老相關蛋白如cyclin A、 cyclin B1等的研究,尚未深入進行,后續工作有待進一步展開。

[1] Hayflick L, Moorhead PS. The serial cultivation of human diploid cell strains[J]. Exp Cell Res,1961, 25: 585-621.

[2] Sikora E, Arendt T, Bennett M, et al. Impact of cellular senescence signature on ageing research[J]. Ageing Res Rev,2011, 10(1): 146-152.

[3] Dimri GP, Lee X, Basile G, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(20): 9363-9367.

[4] Freund A, Orjalo AV, Desprez PY, et al. Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences[J]. Trends Mol Med, 2010, 16(5): 238-246.

[5] Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders[J]. Nature, 2011, 479(7372): 232-236.

[6] Boyce M, Bryant KF, Jousse C, et al. A selective inhibitor of eIF2alpha dephosphorylation protects cells from ER stress[J]. Science, 2005, 307(5711): 935-939.

[7] Liu CL, Li X, Hu GL, et al. Salubrinal protects against tunicamycin and hypoxia induced cardiomyocyte apoptosis via the PERK-eIF2alpha signaling pathway[J]. J Geriatr Cardiol, 2012, 9(3): 258-268.

[8] Wu CT, Sheu ML, Tsai KS, et al. Salubrinal, an eIF2alpha dephosphorylation inhibitor, enhances cisplatin-induced oxidative stress and nephrotoxicity in a mouse model[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(3): 671-680.

[9] Kadomatsu M, Nakajima S, Kato H, et al. Cordycepin as a sensitizer to tumour necrosis factor (TNF)-alpha-induced apoptosis through eukaryotic translation initiation factor 2alpha(eIF2alpha)-and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)-mediated inhibition of nuclear factor (NF)-kappaB[J]. Clin Exp Immunol, 2012, 168(3): 325-332.

[10]Signer RA, Morrison SJ. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(2): 152-165.

[11]Kudryavtseva AV, Krasnov GS, Dmitriev AA,et al. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in aging and cancer[J]. Oncotarget,2016, 7(29): 44879-44905.

[12]Ashok BT, Ali R. The aging paradox: free radical theory of aging[J]. Exp Gerontol, 1999, 34(3): 293-303.

[13]原慧萍,楊澤. 氧化應激與衰老研究進展[J]. 中國老年保健醫學,2015, 13(5): 14-16.

[14]Tchurikov NA, Fedoseeva DM, Sosin DV, et al. Hot spots of DNA double-strand breaks and genomic contacts of human rDNA units are involved inepigenetic regulation[J]. J Mol Cell Biol, 2015, 7(4): 366-382.

[15]Caldecott KW. Single-strand break repair and genetic disease[J]. Nat Rev Genet,2008, 9(8): 619-631.

[16]Lee GH, Lee MH, Yoon YD, et al. Protein kinase C stimulates human B cell activating factor gene expression through reactive oxygen species-dependent c-Fos in THP-1 pro-monocytic cells[J]. Cytokine, 2012, 59(1): 115-123.

Intervention of cellular senescence by Salubrinal through inhibition of oxidative stress

LIMin-chao,TANGWei,LOUQing-lin,GULiu-bao.

DiabetesCenter;

SHUTing-ting.

CentralLaboratory,JiangsuGeriatricHospital,Nanjing210024;

LIMin-chao.

NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China

Objective To investigate the protective effects of Salubrinal on Etoposide-induced cellular senescence in tubular epithelial cells (NRK-52E), and to explore the possible mechanisms. Methods NRK-52E cells were divided into control group (control), senescence group (Etoposide 1 μg/ml) and salubrinal-treated group (Etoposide 1 μg/mL+Salubrinal 50 μM). After 24 h of intervention, cells were observed under an inverted microscope for cellular morphology and β-galactosidase activity (SA-β-gal) staining to detect cell senescence. The cellular senescence was further confirmed by a luciferase reporter system reflecting p16 promoter activity. The levels of ROS were tested using a ROS-DCFH assay. In addition, the expressions of c-fos and the marker of oxidative stress were tested by western blot. Results Treatment with Etoposide for 24 h obviously induced cellular senescence in NRK-52E cells, including morphological changes, positive SA-β-gal staining, and increased p16 promoter activity. The intervention of Salubrinal markedly attenuated NRK-52E cell senescence. Etoposide induced the production of ROS and expression of c-fos, which were suppressed by the treatment with Salubrinal. Conclusions Salubrinal may attenuate Etoposide-induced NRK-52E cellular senescence by inhibiting oxidative stress.

Salubrinal; senescence; oxidative stress; protection

國家自然科學基金青年科學基金項目(81300257)

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫院糖尿病防治研究中心(李敏超,唐偉,婁青林,顧劉寶)；中心實驗室(束婷婷)；210029江蘇省南京市，南京中醫藥大學第一臨床醫學院(李敏超)

顧劉寶，Email：abobgu@sina.com

R 592

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.008

2016-06-19)