生防芽孢桿菌高密度發酵技術研究進展

鄭雙鳳，譚石勇，譚武貴，羅志威，徐滔明，張冬雪，豐 來

（農業部植物營養與生物肥料重點實驗室，湖南泰谷生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410205）

生防芽孢桿菌高密度發酵技術研究進展

鄭雙鳳，譚石勇，譚武貴，羅志威，徐滔明，張冬雪，豐 來

（農業部植物營養與生物肥料重點實驗室，湖南泰谷生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410205）

低成本、高效率的高密度培養工藝和技術是近年來研究芽孢桿菌菌劑工業化生產的熱點。影響高密度發酵的因素非常多，包括菌種、培養基組成、培養條件、培養方式等。對影響芽孢桿菌高密度發酵主要因素的研究進展進行了綜述，旨在為芽孢桿菌的高密度發酵提供相關理論依據與技術指導。

芽孢桿菌；高密度培養；研究進展

高 細 胞 密 度 發 酵（high cell density fermentation，HCDF）是指在一定的培養條件和體系內，在不影響胞內產物積累的基礎上，盡可能多的積累生物量。工業化發酵生產就是要以最低的生產成本獲取最高的細胞或代謝產物收益，因此低成本、高效率的高密度培養工藝和技術逐漸成為國內外發酵研究工作者關注的焦點。影響高密度發酵的因素很多，如菌種的選擇、培養基組成、培養條件、培養方式等。

芽孢桿菌是廣泛存在于土壤和自然界中的優勢菌株，由于其大多數無毒、對人畜無害、能夠分泌抗菌蛋白、抗生素、酶、多肽或脂類[1]等活性物質，促進植物生長，防治植物病害，且具有繁殖速度快、抗逆性強、易定植于植物根際等優點，成為目前研究最多的植物促生細菌與植病生防細菌[2-3]。活菌數與芽孢率是影響芽孢桿菌菌劑生防效果的關鍵因素，且芽孢具有耐酸、耐堿、耐熱、抗干燥、便于運輸與使用等優勢[4-5]，因此應用高密度發酵技術提高芽孢桿菌有效活菌數與芽孢率是近年來研究的熱點。筆者就影響芽孢桿菌高密度發酵主要因素的研究進展進行綜述，旨在為芽孢桿菌的高密度發酵提供理論與技術指導。

1 菌種選育

芽孢桿菌種類多，不同芽孢桿菌的生長與代謝存在較大差異，目前在生物防治領域研究較多的 有 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）[6]、 地 衣 芽 孢桿 菌（Bacillus licheniformis）[7]、 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（Bacillusamyloliquefaciens）、 膠 質 芽 孢 桿 菌（Bacillus mucilaginous）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等。為了能夠盡量縮減成本，增加目標產物產量，提高效益，需要對發酵菌種進行選育，常用的選育方法有自然選育、誘變選育、遺傳改造等。經過選育的芽孢桿菌需具有安全無毒、生長迅速、生物量高、良好的產芽孢能力或者高產功能產物等性能[8]。

1.1 野生型菌株自然選育

自然選育野生型菌株的關鍵在于根據所需菌種特性建立方便、快捷、有效的篩菌模型。李姝江等[8]以腐皮鐮刀菌 [Fusarium solani（Mart） Sacc.]為供試病原菌，采用點菌法與打孔法從花椒根際土中分離篩選得到一株編號為B3的芽孢桿菌對花椒根腐病具有較強的拮抗效果。武志江等[9]以強致病力的百合尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為靶菌，采用平板對峙法最終篩選得到一株具有較強拮抗活性的拮抗細菌，解淀粉芽孢桿菌 11B91。Huang 等[10]結合平板與盆栽試驗，得到了一株對番茄細菌性枯萎病病原具有較強拮抗效果的解淀粉芽孢桿菌 WF02。郭榮君[11]等利用營養競爭平板篩選法獲得了拮抗大豆根腐病菌 Fusarium oxysporum 和 F. solani的 枯 草 芽 孢 桿 菌 菌 株 B006 和B010，通過田間小區試驗證明，其對大豆根腐病的防治效果分別為 74.6% 和 63.5%，并具有增產效果。

1.2 誘變選育

從自然界分離的野生菌菌株其生防效果通常不理想，而人工誘變選育操作簡單、快速，不僅可以提高野生型菌株產量，還能改造其生長代謝活動，是實驗室與工業生產上較常用的菌種選育方法之一。根據誘變劑的不同可分為物理誘變與化學誘變。閆冬等[12]采用亞硝基胍（NTG）誘變，篩選得到兩株高產 LI-F類抗菌酯肽的多粘類芽孢桿菌突變株 N1-37 和 N2-27。李娜等[13]采用 UV 和 NTG 復合誘變的方法，獲得了2株傳代穩定、毒力強、抗逆性好、對一品紅灰霉病的相對防效可達 85% 以上的枯草芽孢桿菌 Bs-a的突變菌株 D17 和 W03。

1.3 遺傳改造

通過基因工程手段對生防芽孢桿菌進行改造或對其產物進行改良是獲得高效生防芽孢桿菌的重要途徑。近年來在這一方面，我國已取得顯著成果。胡曉璐等[14]建立了短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus DX01）菌株的 Tn5 轉座突變株抑稻瘟病活性的高效篩選體系，利用 Tn5 轉座子插入突變獲得大量突變株，最后篩選出6株與對照株抑制稻瘟病菌活性顯著變化的突變株，其中突變株 Tn5-901 對真菌孢子萌發的抑制率為 96%，遠高于對照 DX01 36% 的抑制率。劉麗霞等[15]運用同源重組的方法將外源有活性的 sfp 基因整合入芽孢桿菌 B. subtilis168 菌株中，將其改造為產surfacrin 的菌株。朱震等[16]根據脂肽類 物質合成編碼基因（sfp、ituD 和 lpa-14 基因）設計引物，結合PCR 的方法，篩選到一株具廣譜抗菌活性且含有 sfp、ituD 和 lpa-14 這 3 個關鍵基因的解淀粉芽孢桿菌 XZ-173，該菌對立枯絲核菌和青枯菌具有出很好的拮抗活性，對根結線蟲也有很好的抑制作用。

2 培養基組成

培養基的營養成分如碳源、氮源、無機鹽和生長因子等是細胞生長與繁殖所必需的。高密度培養時，培養基營養成分組成及比例要恰當，尤其是碳氮比（C/ N），如 C/N 過低，發酵起始階段菌體大量繁殖，導致菌體提前自溶，不利于芽孢的形成 ；而 C/N 過高，則菌體繁殖減少，發酵后期活菌及芽孢總量偏低。因此單純增加營養物質用量的方法并不能實現高密度發酵，在芽孢桿菌高密度培養時，應根據菌種及所需產物特點，優選來源容易、價格低廉、利于生長且芽孢產率高的培養基成分用于工業生產。

2.1 碳 源

碳源既是構成細胞及代謝產物必不可少的結構物質，又是維持細菌生長代謝所需能源的原料。發酵過程中，不同芽孢桿菌的生理特性存在差異，因此高密度發酵過程中，所需碳源種類與濃度亦不完全相同。芽孢桿菌高密度發酵中，最常用碳源為葡萄糖、蔗糖。Posada 等[17]在研究培養基組分與培養條件對枯草芽孢桿菌 EA-CB0575 活菌數與芽孢產率影響時發現，葡萄糖為最佳碳源，在含葡萄糖與 MgSO4·7H2O的培養基中，芽孢數達 8.78×109CFU/mL，芽孢率高達 94.2 %。為減少生產成本，麩皮、玉米淀粉、糖蜜等廉價碳源越來越多被采用，且這些天然培養基中的某些成分能夠促進芽孢的形成，如玉米漿中的維生素 B1 已被證明對芽孢形成有促進作用[18-19]。Chen等[20]利用玉米粉、豆粉及酵母粉發酵枯草芽孢桿菌WHK-Z12 可得到較高的芽孢產量。林戎斌等[21]對地衣芽孢桿菌CHB6的液體發酵培養基成分進行篩選優化，結果表明，碳氮源對結果的影響最大，其最適碳源為 1.5% 的糖蜜，其余組分分別為 0.5% 大豆蛋白胨、0.15%K2HPO4·3H2O、1.5%NaCl，此時 CHB6 活菌數最高可達 4.8×109CFU/mL。

2.2 氮 源氮素是構成芽孢桿菌細胞及其代謝產物的另一重要營養物質，因此氮源成為影響芽孢桿菌高密度發酵的關鍵因素之一。氮源分為有機氮源與無機氮源兩類。研究表明，無機氮源比有機氮源更易被菌體直接吸收利用，而有機氮源則會對菌體增殖和芽孢形成產生明顯的促進作用，因此目前芽孢桿菌高密度發酵多使 用 復 合 氮 源。 李 達 等[22]利 用 酵 母 粉 3%、 黃 豆 粉

2%、NH4Cl 3% 作為枯草芽孢桿菌 NKY 1145 的氮源，最 大 活 菌 數 達 6.3×109CFU/mL。 解 順 昌 等[23]將 蛋白胨 1.5%、豆粕 1%、酵母粉 0.5% 作為地衣芽孢桿菌 YTDY-01 的氮源，成孢率約為 96.2%，芽孢數量達到 78.3±6.4×108CFU/mL。Rao 等[24]在優化 Bacillus amyloliquefaciens B128 培 養 基 時 得 出 最 適 的 氮 源 為0.18%（NH4）2SO4、0.8% 蛋 白 胨， 發 酵 后 芽 孢 數 為5.93×108CFU/mL。

2.3 無機鹽及其他

培養基中無機鹽與微量元素對芽孢桿菌高密度發酵也有較大影響，一般常用的無機鹽包括鈣鹽、鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽、鐵鹽等。林成強等[25]對CHB6產芽孢培養基進行了研究，結果顯示無機鹽離子對 CHB6 的菌體量及其芽孢形成均具有影響，其中 Mn2+離子的影響最大。Díaz-García 等[26]利用硝酸鐵與鹽等處理解淀粉芽孢桿菌 BS006，使其芽孢數由起始的1×108CFU/mL 升高到 1.05×1010CFU/mL，芽孢率達88.7%。臧超群等[27]發現 NaCl對生防菌 S286 的菌體生長有促進作用。王西詳等[28]對枯草芽孢桿菌 NS178發酵培養基進行優化，得出（NH4）2SO4、K2HPO4對菌體生產影響較大，優化后 NS178 發酵液菌落數為34.50×108CFU/mL，培養 72 h 時芽孢率達到 75.8%。還有研究表明，Ca2+能夠提高芽孢產量[29-31]；添加芽孢桿菌核糖核酸酶會促進菌體生長與芽孢萌發[32]，提高發酵活菌數與芽孢率。

3 培養條件

在芽孢桿菌高密度發酵過程中，除了需要適宜的營養條件外，培養條件也至關重要，要得到高密度的活菌或芽孢，要求發酵保持在適宜的環境條件下進行，其條件主要包括 pH 值、溶氧、溫度、種齡與接種量等。

3.1 pH 值

pH值是芽孢桿菌高密度發酵極為重要的一個條件因子，發酵過程中需要充分考慮對象芽孢桿菌的最適 pH 值范圍，并在發酵過程中維持穩定的 pH 值，避免pH值急劇變化，對細胞生長和代謝造成不利影響。芽孢桿菌發酵過程中，pH值一般呈先降后升趨勢，培養基配制時應充分考慮其代謝對培養體系pH值緩沖體系的貢獻，定時補料加入酸或堿[33]。芽孢桿菌發酵的 pH 值一般控制在 6.0～7.5 之間。胡秀芳等[34]通過添加碳酸鈣調節發酵液的 pH 值，從而防止菌體自溶和促進芽孢形成。

3.2 溶 氧

溶解氧濃度是限制芽孢桿菌高密度發酵的又一關鍵因素。各種微生物對發酵液中溶氧濃度有一個最低的要求，這一溶氧濃度叫做臨界氧濃度（C臨界），每一種微生物都有自己特定的C臨界，而細菌的C臨界一般為 3%～10%，如枯草芽孢桿菌 CS27 的發酵罐最適攪拌速度為 180 r/min，其 C 臨界約為 10%[35]，一些好氧菌的最適溶氧可高達 30%。發酵過程中一般通過控制發酵罐的通氣量與攪拌速度來維持最適需氧量。Kupriyanova 等[36]研究球形芽孢桿菌芽孢形成與溶解氧的關系時發現，隨著溶解氧濃度升高，芽孢形成率也隨之提高。鐘蔚[37]發現通過提高通氣量和攪拌轉速，可以有效促進枯草芽孢桿菌 BS1 的生長繁殖，提高菌體生成量與芽孢數。但同時也有一些相反的研究結論，這可能與不同菌體的遺傳差異與芽孢形成條件不同有關。

3.3 溫 度

培養溫度是影響細胞生長與代謝的重要因素，高密度發酵應維持在菌體生長繁殖和生物合成所需的最適溫度。不同的芽孢桿菌，其最適生長溫度存在差異，一般控制在 25～40℃。

3.4 種齡與接種量

種子液種齡與接種量對發酵也有較大影響，應選擇處于對數生長中后期的菌體作為種子，并根據實際情況確定接種量。種子太年輕或接種量太少都會出現前期生長緩慢、發酵周期延長的情況；而接種過老的種子，菌體會過早衰退，接種量過大則易使菌體生長過快，均不利于后期生長。芽孢桿菌發酵接種量大多數控制在 4%～10%。吳大華[35]對枯草芽孢桿菌 CS27的發酵條件進行研究，確定最佳工藝條件為種齡 12 h、接種量 10%、培養時間 21 h、攪拌速度 180 r/min、 pH值 6.5、溶氧量 10% ；在此條件下，所獲得的枯草芽孢桿菌 CS27 菌體生物量約為 1.45 ×1010CFU/mL。

4 高密度培養方式

高密度發酵培養方式較多，其中補料分批培養、細胞循環培養、固定化培養較為成熟完善。而芽孢桿菌高密度發酵一般采用補料分批發酵。

4.1 補料分批發酵

補料分批發酵具有操作靈活，染菌、退化概率小、可獲得高的轉化率、對發酵過程可實現控制等優點，通過流加高濃度的營養或前體物質，培養液中細胞濃度可以達到非常高的程度，同時可解除阻遏作用，提高產物得率[38]。

Monteiro 等[39]在枯草芽孢桿菌發酵時發現，通過在對數后期補加葡萄糖，使其濃度維持在 3.5 g/L，既可以解除葡萄糖的阻遏效應，又可以避免在芽孢形成階段葡萄糖濃度過低的限制，提高活菌與芽孢產量。張艷軍[40]對枯草芽孢桿菌 B579 搖瓶發酵補料策略進行了優化，結果表明葡萄糖反饋補料是最佳補料策略，在發酵過程中控制葡萄糖濃度在 3.0～6.0 g/L 范圍內，菌體濃度可達 9.5×109CFU/mL。Monteiro 等[41]在枯草芽孢桿菌發酵對數生長期中后期補加含葡萄糖與鈣的溶液，芽孢產量增加了 5 倍。付維來等[42]通過補加新鮮培養基，延長了地衣芽孢桿菌 M109 的生長周期，提高了發酵水平，菌體濃度由最初的 1.0×109CFU/mL 提高到 1.2×1010CFU/mL。張峰等[43]利用溶氧反饋補料策略進行高密度枯草芽孢桿菌工程菌培養，培養過程中維持 20%～50% 的溶解氧，最終細菌干質量濃度達到 48.1 g/L。

4.2 其 他

芽孢桿菌高密度培養過程中，某些菌會出現代謝阻遏現象，這是可采用過濾培養方式解決這一問題。過濾培養屬于固定化培養的一種。戚薇等[44]利用中空纖維超濾裝置進行 TQ33 高密度培養，在對數后期，當乳酸質量濃度達到 15 g/L 時，開始過濾培養。過濾培養的 6 h 中平均過濾速率和培養基的流入速率為 1 L/h，平均稀釋率為 0.4 L/h ；最終菌體和芽孢濃度分別達到 1.6×1010和 1.2×1010CFU/mL，是分批培養的21倍和37 倍。

5 結論與展望

低成本、高效率的高密度培養是實現芽孢桿菌產品大范圍推廣應用的關鍵技術，現己成為芽孢桿菌菌劑工業化生產的重要研究領域。探索芽孢桿菌高密度發酵的影響因素，提高菌體及芽孢密度以達到高生產率與高效率是該技術研究的主要目標。在芽孢桿菌高密度發酵過程中，不僅需選取最適的發酵菌種，最優的營養成分配比，最佳的培養條件，還需對培養方式做進一步的研究與優化。

近年來，我國芽孢桿菌高密度發酵技術在生產上已得到廣泛應用，并取得了一定成果，但是也存在一些需要解決完善的問題。高密度發酵策略的優化是完善高密度培養技術的首要問題。同時，需要改進發酵設備、加強對在線檢測設備的研發，為發酵調控提供實時、準確的依據，最終實現芽孢桿菌高密度發酵。

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（責任編輯：成 平）

Research Progress of High Cell Density Fermentation Technology in Biocontrol of Bacillus spp.

ZHENG Shuang-feng，TAN Shi-yong，TAN Wu-gui，LUO Zhi-wei，XU Tao-ming，ZHANG Dong-xue，FENG Lai

（Key Laboratory of Plant Nutrition and Biological Fertilizer Ministry of Agriculture, Hunan Taigu Bio-Tech Co. Ltd, Changsha 410205, PRC）

In recent years, high cell density fermentation(HCDF) with advantage of low cost and high effi ciency has been a hot spot in industrial production of Bacillus spp.. The factors, including bacteria, composition of culture medium, culture conditions, training modes, etc. could infl uence on the high cell density fermentation. Research progress of factors that affecting HCDF of Bacillus spp. were summarized in this paper, which provided theoretical basis and technical guidance for the HCDF of Bacillus spp.

Bacillus spp.; high density fermentation; research progress

Q815

A

1006-060X（2017）03-0120-05

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.034

2016-11-25

國家重點研發計劃項目（2016YFD0300904-2）；湖南省重點研發計劃項目（2016NK2016）

鄭雙鳳（1989-），女，湖南衡陽市人，助理工程師，主要從事農用有益微生物篩選與發酵過程優化與控制工作。

豐 來