miRNA—181a在系統性紅斑狼瘡患者血漿中的表達及臨床意義

李紅勝　寧瑤　衡翔　李勝兵　陳松勁　葉俏

[摘要] 目的 研究miRNA-181a檢測在系統性紅斑狼瘡患者臨床診治中的價值。 方法 采用反轉錄PCR法（RT-PCR）檢測36例2015年1～6月來我院門診和住院就診的系統性紅斑狼瘡（SLE）患者及30例同期來我院健康體檢的對照者的血漿miRNA-181a相對表達量，同時測定SLE患者的血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）與免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和補體C3、C4及系統性紅斑狼瘡活動指數（SLEDAI）等，分析miRNA-181a與這些臨床指標的關系。 結果 SLE組miRNA-181a相對表達水平顯著高于健康對照組，SLE活動期組高于SLE穩定期組，差異均有統計學意義（P<0.05）。SLE患者血漿miRNA-181a相對表達水平與血沉、C反應蛋白、SLEDAI評分等呈正相關（r=0.48、0.56、0.62，P均<0.05）。 結論 血漿miRNA-181a濃度在SLE患者體內明顯升高，且與SLE患者目前常用的一些臨床評估指標高度相關，miRNA-181a有可能成為一個新的SLE疾病活動度評估及預后判斷的分子標志物。

[關鍵詞] miRNA-181a；血漿；系統性紅斑狼瘡；臨床指標；反轉錄PCR

[中圖分類號] R593.241 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）32-0037-04

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫介導的以免疫性炎癥為突出表現、常累及多系統、多器官的自身免疫性疾病。SLE病因復雜，發病機制尚不明確，機體的免疫異常被認為是發病的關鍵原因。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中、長度約21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA。它可通過與靶基因mRNA序列的特異性相互作用降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，還可在特定條件下上調靶基因的蛋白表達和mRNA水平。研究表明，在自身免疫性疾病的發生與發展過程中，microRNA發揮著不可忽視的作用[1]。

本研究采用實時熒光定量PCR法檢測36例SLE患者和30例健康人群血漿的miRNA-181a相對表達量，并同時檢測SLE患者血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和補體C3、C4及系統性紅斑狼瘡活動指數（SLEDAI）等，分析miRNA-181a水平與這些臨床指標的關系，探討miRNA-181a在SLE疾病中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1～6月來我院門診和住院就診的SLE患者36例，SLE診斷均符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE診斷指南，排除患有其他全身性疾病的患者。其中男7例，女29例，年齡23～61歲，平均（37±9）歲。系統性紅斑狼瘡活動指數（SLEDAI）≥6（活動期）21例，SLEDAI<6（穩定期）15例；另外選取來我院健康體檢正常的30例人群作為對照人群（正常對照組），排除有高血壓、心臟病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他疾病者，不得具備SLE診斷標準中的任何一條。其中男5例，女25例，年齡21～57歲，平均年齡（36±7）歲，兩組間年齡、性別等差異無統計學意義。患者進入研究后即對患者進行全面的檢查并根據檢查情況計算其SLEDAI評分[2]。血沉的檢測采用魏氏法，C反應蛋白與免疫球蛋白IgG、、IgA、IgM和補體C3、C4的檢測均在Beckman coulter Immage 800上進行。本研究得到了嘉興市第二醫院醫學倫理委員會的批準，所有受試對象均知情同意。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR儀Roche Cobas Z 480購自美國Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度計購自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol RNA提取試劑、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均購自Invitrogell公司。

1.3實驗方法

1.3.1 標本處理 取SLE患者靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g離心10 min后吸取上清血漿至1.5 mL EP管中，再次800 g離心10 min，取上清血漿-80℃冷凍保存，統一檢測。正常對照組標本處理同前。

1.3.2 總RNA的提取與純化 用 Trizol RNA提取試劑盒提取和純化總RNA，按試劑說明書操作。應用Eppendor D30紫外分光光度儀檢測總RNA 濃度和質量，檢測合格者置-80℃冰箱凍存待用。

1.3.3 miRNA-181a的逆轉錄 應用BIOG Super Reverse Transcriptase對提取的總RNA中miRNA逆轉錄成cDNA。按說明書將總RNA 5 μL加入反應體系，miRNA-181a逆轉錄反應條件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；轉錄后得到的cDNA進行real-time PCR或-20℃保存備用。

1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR儀器上進行qRT-PCR。以小分子RNA U6作為內參，所用引物序列見表1。反應體系：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反應條件：95℃ 5 min一個循環，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40個循環，溶解曲線一個循環。實驗重復3次，計算各標本平均Ct值。miRNA-181a的相對含量以2-ΔΔCt表示[3]，ΔΔCt=實驗組ΔCt（目的基因 Ct-內參基因 Ct）-對照組ΔCt（目的基因Ct-內參基因Ct）。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0軟件進行統計分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，miRNA-181a的表達量與SLE臨床指標的相關性采用pearson相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE組和正常對照組血漿中miRNA-181a相對表達量比較

Real-Time PCR檢測結果顯示，SLE組miRNA-181a的相對表達量（0.68±0.19）顯著高于對照組（0.41±0.15），差異有統計學意義（t=3.26，P=0.02<0.05）。

2.2 SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達量與一些常用臨床指標的相關性

SLE活動期患者外周血漿中的miRNA-181a相對表達量顯著高于穩定期患者，差異有統計學意義（t=4.13，P<0.01）（圖1）。相關性分析結果顯示：SLE患者miRNA-181a相對表達水平與SLEDAI積分呈正相關（r=0.62，P=0.043）（圖2），與患者的ESR、CRP也呈正相關（r=0.48、0.56、P均<0.05）（圖3，圖4），與患者的年齡、性別、補體C3、C4水平無相關性（P均>0.05）。

3 討論

miRNA-181作為micro-RNAs的一個家族系列，主要有miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d[4]。在人類中，miRNA-181主要在3個獨立的染色體上編碼，miRNA-181a-1/b-1位于1號染色體上，miRNA-181a-2/b-2位于9號染色體上，miRNA-181c/d位于19號染色體上[5]。miRNA-181家族成員的主要作用機制是通過與靶標mRNA的3-UTR堿基互補結合，抑制其下一步的翻譯功能，或者降低其互補mRNA的穩定性，達到調控相關基因的表達，進而參與各種生理或病理過程作用。miRNA家族成員在基因的功能上并不完全相同[6]，miRNA-181a作為miRNA-181家族中重要一員，在細胞的發展和分化過程中起著尤為重要的作用，它能夠抑制多種細胞增殖并促進細胞凋亡，且在不同組織細胞中具有表達差異[7，8]，研究發現其在癌癥和自身免疫性疾病中常常出現異常高表達或低表達[9]。

系統性紅斑狼瘡作為一種慢性的多器官的自身免疫性疾病[10]，有多種臨床表現型，病程活動期與穩定期呈遷延反復交替出現，嚴重者可導致死亡。在其發展過程中有多種炎癥因子參與其中，如TNF-α、IL-1、IL-6和IFN等，這些炎癥因子通過MAPK通路發揮作用[11]。在該病的發生和發展過程中，miRNA-181家庭均發揮著重要作用[12，13]。

關于miRNA-181a表達水平與SLE疾病的相關性目前有一些相互矛盾的研究結果[9，13-15]，我們利用RT-PCR方法檢測了SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達水平，結果發現SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達水平顯著高于正常對照組（P<0.05），且SLE活動期患者血漿中miRNA-181a相對表達水平顯著高于SLE穩定期患者（P<0.05），這與Carlsen AL[13]、Motawi TK[14]等的研究結果相同。MiRNA-181a表達水平與SLE疾病的相關性可能與miRNA-181a參與調控體內的炎癥反應有關。研究發現miRNA-181a能夠調節IL-8、IL-1α、IL-1β和IL-6等的表達，進而調節炎癥反應[16，17]。其對 IL-8和 IL-1α的表達調控均呈現出反向調節的關系，而對 IL-1β和IL-6 的調控則是正向調控。其可能通過TLR-4通路對這些炎癥因子的表達進行調控[17]。

本研究還分析了SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達水平與一些常見臨床病理特征之間的關系，SLE患者血漿中miRNA-181a相對表達水平高低與患者年齡、性別、補體C3、C4濃度均無明顯相關（P>0.05），miRNA-181a水平與SLEDAI積分、ESR、CRP呈正相關（P<0.05），提示miRNA-181a可能與SLE疾病的臨床活動度及預后有關，但這需要進一步擴大樣本量，同時進行長期隨訪研究。有研究提示SLE發病年齡對臨床疾病的呈現方式、器官受累的模式以及血清學檢查結果都會有不同影響[18-20]，這可能會導致miRNA-181a相對表達量與臨床指標關系在成人SLE患者與兒童SLE患者之間有所不同。本試驗沒有對兒童SLE患者進行相關研究。目前對miRNA-181a作用靶標的鑒別驗證以及其如何導致靶標mRNAs沉默的機制還需進一步的探索研究。

綜上所述，在SLE患者血漿中miRNA-181a的濃度增高，且與疾病的活動度相關，隨著對miRNA-181a研究的不斷深入，miRNA-181a有可能成為SLE早期診斷、臨床活動度評價及預后判斷的新的分子標志物。

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（收稿日期：2016-08-24）