韶關市1190例手足口病病原體檢測結果分析

馬占忠黃文波何鳳屏謝秀萍郭艷樂劉玉蘭

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韶關市1190例手足口病病原體檢測結果分析

馬占忠1★黃文波2何鳳屏1謝秀萍1郭艷樂1劉玉蘭1

目的分析韶關地區手足口病病原體分布情況。方法收集2011年1月～12月的1190例手足口病患者的咽拭子，采用實時熒光PCR方法檢測腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）。結果在1190份標本中病毒核酸陽性率為11.51%（137/1190），其中EV71占60.58%（83/137），CoxA16占39.42%（54/137）；6月份高發，占29.08%（346/1190）；男女比例為1.64:1，且0～4歲的患兒占93.11%。結論韶關地區2011年手足口病病原體以EV71為主，6月份高發，主要分布在0～4歲，男性多于女性，實時熒光PCR可用于手足口病病原體的檢測，對手足口病的診療和防控具有重要意義。

手足口病；腸道病毒71型；柯薩奇病毒A組16型

手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）是有多種腸道病毒感染引起的常見傳染病，主要病原體為腸道病毒71型（Enterovirus71, EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxsackievirusA16, CoxA16）[1]。以手、足、口腔等部位出現斑丘疹、皰疹為主要臨床癥狀。少數患兒可引起腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環障礙等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，會導致死亡。我們采用實時熒光PCR對手足口病患者的咽拭子標本進行檢測，分析手足口病病原體分布特點，對手足口病的監測及防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 2011年1月～12月粵北人民醫院就診的1190例臨床診斷為手足口病患者的咽拭子標本。 臨床診斷標準參見衛生部印發的《手足口病診療指南》[2]( 2010年版) 。

儀器：實時熒光PCR儀、生物安全柜、高速離心機、干式恒溫器。

試劑：EV71和CoxA16檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）。

1.2 方法（參照EV71和CoxA16檢測試劑盒說明書）

1.2.1 樣本處理與RNA提取

收集的咽拭子標本加入200 μL的生理鹽水充分振蕩后離心，去掉部分上層液體直至剩余100 μL，吸打混勻放置于1.5 mL滅菌離心管，加入200 μL Trizol試劑及100 μL氯仿，用振蕩器振蕩20 s后靜置3 min，然后12000 rpm離心2 min；小心吸取無色上層液體，轉移至新滅菌的1.5 mL離心管，然后加入10 μL RNA提取液A，再用振蕩器充分混勻，8000 rpm離心1 min后，小心棄去所有液體；加入溶液C 400 μL，充分振蕩混勻，8000 rpm離心1 min，盡可能將液體去除干凈；將裝有沉淀的離心管于加熱器中，60℃干燥5 min，待沉淀物完全烤干，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混勻管中沉淀，得到白色的懸濁液，可直接用于檢測，也可存于-70℃待用。

1.2.2 PCR擴增

反應體系：RT-PCR反應液15 μL、逆轉錄酶2 μL、Taq酶3 μL；上述PCR反應管中分別加入處理后的陰性質控品、待測樣品混濁液、陽性質控品各5 μL，3000 rpm離心30 s，放入PCR擴增儀。反應條件：40℃ 25 min，1個循環；94℃ 3 min，1個循環；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40個循環。

1.2.3 結果判斷

陰性質控品：無典型S型擴增曲線或無Ct值；陽性質控品：呈典型S型擴增曲線且Ct值≤30；如果檢測結果無典型S型擴增曲線或Ct值＞ 35.1，則判斷標本為陰性；如果檢測結果呈典型S型擴增曲線且Ct值≤35.1，則判斷標本為陽性。

2 結果

2011年粵北人民醫院臨床診斷手足口病有1190例，檢測出病毒核酸137例，其中EV71核酸陽性占60.58%（83/137），CoxA16占39.42%（54/137）。 6月份高發期，占29.08%（346/1190）（見表1），患者主要分布在0～4歲，占93.11%（1108/1190）（見表2），男性739例，女性451例，男女比例為1.64:1，男性多于女性（見表3）。

3 討論

本次對韶關市2011年手足口病病原體進行檢測分析，發現以EV71感染為主，主要集中在4歲以下兒童，且男性多于女性，高發期在6月份，11月份發病率較高可能是由于韶關市2011年11月氣溫驟降，兒童免疫力較弱而容易感染。目前檢測手足口病病原體有核酸檢測、病毒分離和抗體檢測等方法。病毒分離檢測時間長、操作繁瑣、不能同時檢測大量標本；ELISA法檢測抗體經濟快速，但由于病毒感染到抗體出現需要一段時間，且需要急性期與恢復期雙份血清，用于疾病的早期診斷靈敏度不高[3]；熒光定量PCR能快速靈敏的檢測手足口病病原體的特異性核酸，是手足口病流行期間大批量標本檢測的首選方法。

[1]倪語星, 尚紅, 等. 臨床微生物學與檢驗[M]. 第4版. 北京:人民衛生出版社, 2009: 436-437.

[2]中華人民共和國衛生部. 手足口病診療指南(2010年版)[J].國際呼吸雜志, 2010, 30(24): 1473-1475.

[3]喬鳳嬌, 劉紅, 劉漢芬. 實時熒光PCR技術檢測手足口病EV71與CA16病毒核酸[J]. 中國衛生工程學, 2011, 10(3): 253.

Analysis and pathogenic diagnosis of 1190 hand-foot-mouth disease in Shaoguan

MA Zhanzhong1★, HUANG Wenbo2, HE Fengping1, XIE Xiuping1, GUO Yanle1, LIU Yulan1
(1.Department of Clincal Laboratory, Yuebei People's Hospital of Shantou University Medical College, Guangdong, Shaoguan 512026; 2.Shaoguan Medical College, Guangdong, Shaoguan 512026)

Objective To analyze the pathogenic diagnosis of the hand-foot-mouth disease (HFMD) in the city of Shaoguan. Methods Throat swab of 1190 HFMD patients were collected from January to December in 2011. Real-time PCR was used to detect enterovirus71 (EV71) and CoxsackievirusA16 (CoxA16).

Results The positive rate of the virus nucleic acid was 11.51%(137/1190), EV71 was 60.58%(83/137) , CoxA16 was 39.42%(54/137). The peak of HFMD infection ratio was 29.08%（346/1190）in June. Male to female ratio was 1.64:1, 0～4 years old children accounted for 93.11%. Conclusions HFMD was mainly caused by EV71 in Shaoguan 2011. The peak of HFMD was in June and mainly distributed in 0～4 years old children. Male more than female. Real-time PCR can be used to pathogenic diagnosis of HFMD, which plays an important role in diagnosis, treatment, prevention and control of HFMD.

Hand-foot-mouth disease; Enterovirus71; CoxsackievirusA16

表2 手足口病各年齡段分布情況Table 2 The age distribution of HFMD

1. 汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院檢驗科，廣東，韶關512026 2. 韶關學院醫學院，廣東，韶關512026

★通訊作者：馬占忠，E-mail：mazhanzhong816@163.com