成釉細胞瘤患者的EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號傳導通路研究

王禹錕 孫越 董文杰 吳婷

成釉細胞瘤患者的EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號傳導通路研究

王禹錕 孫越 董文杰 吳婷

目的探討促紅細胞生成素(EPO)/促紅細胞生成素受體(EPOR)-激活的蛋白酪氨酸激酶-2(JAK2)-信號轉導子和轉錄激活子5(STAT5)信號通路在成釉細胞瘤(AB)中的表達及意義,就AB的發病機制進行深入探索。方法采用免疫組化法對34例AB、8例牙源性角化囊腫(OKC)及7例牙胚(TG)三組標本中上述四種蛋白的表達進行檢測。結果EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無統計學意義(P＞0.05)；OKC表達與另兩組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。叢狀型AB表達明顯高于濾泡型AB,差異有統計學意義(P＜0.05)。無細胞變異型AB的表達明顯高于顆粒細胞型AB,差異有統計學意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當中,許多腫瘤細胞表達強烈。EPO于上皮細胞成分相應胞漿當中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達水平,而對于在OKC中的表達而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統計學意義(P＜0.05)。許多AB表達于中央星網狀細胞、立方細胞或外周柱狀細胞。諸多濾泡型AB的立方細胞或外周柱狀細胞,在顏色方面,均略強于中央多邊形細胞。AB、OKC與TG組間JAK2在細胞核及細胞漿中的表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細胞亞型、棘皮瘤亞型及細胞變異亞型表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。結論EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號傳導通路在AB、OKC及TG之間,以及AB的各亞型及各分型間均具有顯著的表達。EPO/EPOR在AB中、瘤樣病變及牙源性組織當中,利用JAK2-STAT5信號途徑實現其作用的充分發揮,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相應異常活化與AB的發生與發展有關。

成釉細胞瘤；促紅細胞生成素；促紅細胞生成素受體；激活的蛋白酪氨酸激酶；信號轉導子和轉錄激活子

AB乃是來源于上皮且具有最高發病率的牙源性腫瘤,當前以對此存有諸多病理分型,盡管均為良性腫瘤,但具有一些惡性腫瘤的相應生物學行為,存在惡變潛能、侵襲性生長及高復發率等特點,所以有學者將其劃定為臨界瘤［1-5］。近些年來,有關AB當中蛋白與基因異常的表達日益報道增多［6-13］,但在研究AB發生與發展方面的型號傳導通路卻比較少。本次研究通過運用免疫組化方法,將OKC與TG作為對照組,將AB及其亞型、分型作為實驗組,就AB、TG和OKC當中EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號傳導通路的意義與表達,因此就其在OKC與AB的發生、發展,以及其在TG發育中所發揮出的作用予以明確。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年6月～2016年6月在本院口腔頜面外科行手術切除治療的34例AB標本為AB組、8例OKC標本為OKC組、7例TG標本為TG組。TG 組來自7例下頜阻的第三磨牙時所收集的處于發育狀態的牙胚,男4例,女3例,中位年齡13歲；OKC組8例標本分別來自上頜骨與下頜骨,各4例,男3例,女5例,中位年齡35歲；34例AB標本來自下頜28例,上頜6例,男19例,女15例,中位年齡32歲。依據組織學模式將AB組標本分類,即亞型包括：23例非細胞變異型、7例棘皮瘤型、4例顆粒細胞型；叢狀型15例,濾泡型19例。

1.2 實驗方法 試劑：SC-836：兔抗人STAT5多克隆抗體STAT5、SC-695：兔抗人EPOR多克隆抗體、SC-1310：山羊抗人EPO多克隆抗體EPO,均選自Santa Cruz公司。免疫組化S-P染色購買自廣州博士德有限公司。全部標本均采用中性福爾馬林(10%)浸泡固定,時間為24 h,運用酒精將其逐級脫水,運用二甲苯將其透明,用石蠟將其包埋,持續切片(3 μm),分別實施免疫組化染色與組織學染色。運用免疫組織化學S-P法,各項操作流程均需依據試劑盒說明書來完成,運用已知陽性片實施陽性對照,選用PBS取代第一抗體實施陰性對照,其他流程均相同。

1.3 結果判定 本次研究采用Leica DM 2500顯微鏡,Motic6.0采集系統［14］。由病理專家審閱免疫組織化學片與H.E片子。本次試驗所獲取的蛋白,若在胞核、胞膜及胞漿中呈現為棕黃色顆粒狀,則將其定為陽性著色。牙源性腫瘤與牙源性組織相應免疫組化結果所持有的評價標準：依據免疫組化染色強度及陽性細胞百分數,將其劃分為三組,即＞65%細胞染色強度,則反映此樣本所持有的免疫組化反應性：(-)陰性,細胞不存在著色狀況；(+)表示弱陽性至中度陽性,顏色從淺黃色至棕黃色；(++)表示強陽性,顏色為棕褐色［15］。

1.4 統計學方法 采用Rversion 2.4.1統計學軟件進行統計分析。采用Kruskal-Wallis test及Mann-Whitney U-test對組間差異進行檢測。P＜0.05表示存有統計學差異。

2 結果

EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無統計學意義(P＞0.05)；OKC表達與另兩組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。部分TG上皮能夠發現處于增殖活躍狀態的上皮島,而對TG上皮島及上皮均存在有十分強的陽性表達。叢狀型 AB表達明顯高于濾泡型AB,差異有統計學意義(P＜0.05)。無細胞變異型AB的表達相比于顆粒細胞型AB,前者明顯高于后者,差異有統計學意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當中,許多腫瘤細胞表達強烈。對于一些濾泡型AB,其呈現出一種相應芽樣生長狀態,陽性表達強烈。針對AB當中帶有牙齦黏膜的組織切片,通過對牙齦黏膜下方進行觀察,可發現其間質當中的serres上皮仍然存在有強陽性表達。EPO于上皮細胞成分相應胞漿當中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達水平,而對于在OKC中的表達而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統計學意義(P＜0.05)。許多AB表達于中央星網狀細胞、立方細胞或外周柱狀細胞。諸多濾泡型AB的立方細胞或外周柱狀細胞,在顏色方面,均略強于中央多邊形細胞。針對叢狀型AB而言,不管是中央細胞還是外周細胞,其多數情況均具有較強的表達。AB、OKC與TG組間JAK2在細胞核及細胞漿中的表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細胞亞型、棘皮瘤亞型及細胞變異亞型表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1,表2。

表1 牙胚、牙源性角化囊腫和成釉細胞瘤中EPO和EPOR的免疫組化表達(n)

表2 牙胚、牙源性角化囊腫和成釉細胞瘤中STAT5在胞漿和胞核中的免疫組化表達(n)

3 討論

EPO要想發揮出其作用,首先需將EPOR激活,然后將下游的信號傳導通路激活,由此方能實現。JAK2是EPOR直接而又單獨性的下游信號分子。老鼠實驗可知,如若缺乏JAK2,會因紅細胞生成出現障礙,而幼鼠死于子宮中,也就是缺乏JAK2的細胞,沒有應答上游 EPO。而對于STAT5而言,其乃是JAK2所持有的下游底物,關系到紅系祖細胞能夠長久生存。另外,如若小鼠STAT5a缺乏,還會導致泌乳能力逐漸喪失的狀況,此結論一致于STAT5 是一種乳腺因子。當STAT5b缺乏時,則兩性分化能力則會由此而喪失。由此可知,JAK-STAT 信號通路對胚胎發育具有良好的作用。又有研究可知,相比于處于正常狀態的口腔黏膜當中的微弱表達,處于發育狀態的STAT5與JAK2,其牙胚當中的表達更強。由此可知,針對JAK-STAT信號通路,可利用旁分泌及自分泌方式,積極參與到人類牙胚的發育過程中。另外,在胞漿中的表達,JAK2要明顯強于胞核,而在胞核當中,STAT5的表達也要強于胞漿,由此知曉兩者的定位位置。通過本次研究可知,EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無統計學意義(P＞0.05)；OKC表達與另兩組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。部分TG上皮能夠發現處于增殖活躍狀態的上皮島,而對TG上皮島及上皮均存在有十分強的陽性表達。叢狀型 AB表達明顯高于濾泡型AB,差異有統計學意義(P＜0.05)。無細胞變異型AB的表達相比于顆粒細胞型AB,前者明顯高于后者,差異有統計學意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當中,許多腫瘤細胞表達強烈。對于一些濾泡型AB,其呈現出一種相應芽樣生長狀態,陽性表達強烈。針對AB當中帶有牙齦黏膜的組織切片,通過對牙齦黏膜下方進行觀察,可發現其間質當中的serres上皮仍然存在有強陽性表達。EPO于上皮細胞成分相應胞漿當中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達水平,而對于在OKC中的表達而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統計學意義(P＜0.05)。許多AB表達于中央星網狀細胞、立方細胞或外周柱狀細胞。諸多濾泡型AB的立方細胞或外周柱狀細胞,在顏色方面,均略強于中央多邊形細胞。針對叢狀型AB而言,不管是中央細胞還是外周細胞,其多數情況均具有較強的表達。AB、OKC與TG組間JAK2在細胞核及細胞漿中的表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細胞亞型、棘皮瘤亞型及細胞變異亞型表達比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可知,上述因子程度差異性與牙源性腫瘤及牙源性組織的發生發展有關；EPO/EPORJAK2-STAT5a信號通路不僅對于頭頸部鱗狀細胞癌相應侵襲性當中存在作用,而且在頭頸部組織及牙源性腫瘤當中,同樣發揮著作用,由此表明,此通路可能在頭頸部腫瘤當中廣泛存在；基于形態學角度來講,觀察到了口腔黏膜、serras上皮剩余及殘余牙胚上皮等,乃是造成AB組織發生與發展的重要誘因。

綜上所述,EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號傳導通路在AB、OKC及TG之間,以及AB的各亞型及各分型間,均具有顯著的表達。EPO/EPOR在AB中、瘤樣病變及牙源性組織當中,利用JAK2-STAT5信號途徑實現其作用的充分發揮,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相應異常活化與AB的發生與發展有關。

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Research of signal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 in ameloblastoma patients

WANG Yu-kun,SUN Yue,DONG Wen-jie,et al.Department of Stomatology,Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157000,China

ObjectiveTo investigate expression and significance by signal transduction pathway of erythropoietin(EPO)/erythropoietin receptor(EPOR)-activated protein tyrosine kinase-2(JAK2)-signal transducers and activators of transcription 5(STAT5) in ameloblastoma(AB),and to make further exploration of pathogenesis in AB.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detect expression of the four protein in 34 AB samples,8 odontogenic keratocyst(OKC) samples and 7 tooth germ(TG) samples.ResultsEPOR generally distributed in epithelial cytomembrane and cytoplasm in AB,OKC and TG,and there was no statistically significant difference between TG and AB(P＞0.05),while OKC had statistically significant difference comparing with the other two groups(P＜0.05).Expression of plexiform type AB was obviously higher than follicular type AB,and their difference had statistical significance(P＜0.05).Expression of non-cytometaplasia AB was much higher than granular cell type AB,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Tumor cells showed strong expression in plexiform type AB.Distribution of EPO was mainly in epithelial cell cytoplasm,and its expression was similar in AB and TG,while its expression in OKC was obviously lower than TG.The difference had statistical significance(P＜0.05).Main expression of AB occurred in central stellate reticulum,cuboidal cell and peripheral columnar cell.Cuboidal cell and peripheral columnar cell in follicular type AB had darker color than central stellate reticulum.The difference of expression of JAK2 in cell nucleus and cytoplasm across AB,OKC and TG had statistical significance(P＜0.05).The difference of expression of JAK2 had statistical significance acrossgranular cell subtype,acanthoma subtype and cytometaplasia subtype(P＜0.05).ConclusionSignal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 shows remarkable expression in AB,OKC,TG and subtypes of AB.EPO/ EPOR shows its effect fully by signal pathway of JAK2-STAT5 in AB,tumor-like lesion and odontogenic tissues.Abnormal activated EPO/EPOR-JAK2-STAT5 pathway is correlated with occurrence and development of AB.

Ameloblastoma; Erythropoietin; Erythropoietin receptor; Activated protein tyrosine kinase; Signal transducers and activators of transcription

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.016

2016-12-09］

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(項目編號：12541851)

157000 牡丹江醫學院附屬二院口腔科(王禹錕董文杰 吳婷)；哈爾濱市第四醫院口腔科(孫越)

吳婷