異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因阿爾茨海默病小鼠學習記憶和腦組織RAGE、LRP1蛋白表達的影響

塔依爾·吐爾松，阿地蘭·沙拉木，蘭希，孫龍飛，努爾買買提·艾買提

1.新疆醫科大學維吾爾醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011

異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因阿爾茨海默病小鼠學習記憶和腦組織RAGE、LRP1蛋白表達的影響

塔依爾·吐爾松1，阿地蘭·沙拉木2，蘭希2，孫龍飛3，努爾買買提·艾買提1

1.新疆醫科大學維吾爾醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011

目的觀察異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因阿爾茨海默?。ˋD）小鼠學習記憶和腦組織RAGE、LRP1蛋白表達的影響，探討其作用機制。方法選取3月齡APP/PS1轉基因AD模型小鼠并將其隨機分為模型組、陽性藥組和異常黏液質成熟劑高、中、低劑量組，每組18只，另取18只3月齡C57BL/6J小鼠作為正常組。各給藥組給予相應藥物灌胃，連續6個月。跳臺實驗觀察小鼠學習和記憶能力；免疫組化和Western blot檢測LRP1、RAGE蛋白表達。結果與正常組比較，模型組學習成績反應期時間和錯誤次數增加，記憶成績潛伏期時間減少、錯誤次數增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組學習成績反應期時間和錯誤次數減少，記憶成績潛伏期時間增加、錯誤次數減少（P＜0.05，P＜0.01）；免疫組化和Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腦組織LRP1表達降低、RAGE表達增加（P＜0.05)；與模型組比較，異常黏液質成熟劑各劑量組小鼠腦組織LRP1表達增加、RAGE表達降低（P＜0.05，P＜0.01)。結論異常黏液質成熟劑可改善APP/PS1轉基因AD小鼠空間學習記憶能力，調整RAGE和LRP1的表達。

異常黏液質成熟劑；APP/PS1轉基因小鼠；空間學習記憶；海馬CA1區；RAGE；LRP1

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，以多種原因引起的記憶和認知功能障礙及神經功能受損為主要特征。AD屬于維醫學異常體液所致“失憶”“失眠”“愚蠢”等范疇。在早期的輕度認知功能障礙期，異常黏液質在臨床表現中占主要地位[1]。本實驗觀察異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因AD模型小鼠學習記憶和腦組織RAGE、LRP1蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

3月齡APP/PS1轉基因AD模型雄性小鼠90只，SPF級，體質量（25±2）g；3月齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠18只，體質量（25±2）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2009-0004。小鼠飼養于新疆醫科大學SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物

異常黏液質成熟劑，新疆醫科大學維吾爾醫學院；鹽酸多奈哌齊，衛材（中國）藥業有限公司，批號061653928914，使用前粉碎，用蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑與儀器

RAGE抗體、LRP1抗體（美國Abcam）。封閉用山羊血清、羊抗兔二抗、DAB顯色液、BCA定量檢測試劑盒、山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP、山羊抗兔IgG（H+L）-HRP、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）、SDS-PAGE電泳緩沖液、ECL Western Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒，CWbio.Co.Ltd。BS-1105型電子天平（北京Sartorius天平有限公司），OLYMPUS CX-3雙目顯微鏡（日本OLYMPUS），Laica DM300圖像采集系統（德國Laica）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

將90只轉基因AD小鼠隨機分為模型組、陽性藥組和異常黏液質成熟劑高、中、低劑量組（高、中、低劑量組），每組18只；同時以18只相同月齡的C57BL/6J小鼠作為正常組。實驗小鼠給藥6個月后，做行為學實驗。依據異常黏液質成熟劑的臨床應用劑量換算成小鼠給藥劑量，低、中、高劑量組分別按1.5、2、3 g/（kg·d）予異常黏液質成熟劑灌胃，陽性藥組予0.92 mg/（kg·d）多奈哌齊灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為1 g/0.1 mL，按照病情初步嘗試給藥6個月。實驗階段所有小鼠均正常飲食和飲水，每日1次。

2.2 跳臺實驗

小鼠在跳臺測試箱內放置5 min，使其適應測試箱內環境后通電。小鼠受到電擊時跳回跳臺，大多數小鼠可以多次跳上跳下，以小鼠第2次從跳臺跳下，記為第1次錯誤次數。訓練時間為5 min，記錄5 min內錯誤次數。第2日開始測試記憶能力，直接把小鼠放在安全跳臺上后再通電，記錄5 min內小鼠停止的時間（即潛伏期）和錯誤次數。

2.3 免疫組化檢測

烤箱內烤溶標本置于二甲苯Ⅰ內脫蠟。染色前石蠟切片脫蠟，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 10 min，無水乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、80%乙醇各5 s，再水洗，3%H2O2室溫10 min消除內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次×5 min，PBS洗3次×5 min。0.01 mol/L檸檬酸抗原修復液，微波修復10 min，室溫冷卻，蒸餾水沖洗3×5 min，PBS沖洗3×5 min，加一抗，4 ℃冰箱過夜，PBS洗3×5 min，滴加通用免疫球蛋白G抗體聚合物（二抗），37 ℃溫箱25 min孵化，PBS沖洗3×5 min，新鮮制備DAB顯色液自來水終止顯色，Hematoxylin復染5～10 min，蒸餾水洗滌，鹽酸乙醇分化，返藍，脫水，透明，取出封片，組織學實驗室通風櫥內進行檢測。

2.4 Western blot檢測

小鼠全腦勻漿，Western blot測定整個大腦RAGE、LPR1蛋白含量。蛋白樣品處理：每孔取50 μg蛋白上樣，將樣品置于水浴鍋煮沸5 min，冰浴5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。SDS-PAGE電泳：加入提前準備好的蛋白樣品，每孔上樣量為20 μL，蛋白Marker上樣量為10 μL，積層膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。轉膜：將剪裁完畢PVDF膜甲醇中浸泡5 min，轉移盤中加入少量轉移緩沖液，將剪裁完畢8張濾紙浸泡，轉移板放置轉移盤中，將4張濾紙放置在轉移板海綿墊上的中間位置，在濾紙上小心平鋪凝膠，將PVDF膜覆蓋于分離膠上面，標記好Marker位置后，再放置4張濾紙，趕走氣泡。80 V恒壓4 ℃進行半干轉。封閉：轉膜結束后，PVDF膜于溫搖床封閉1 h，TBST沖洗3次×5 min。孵育抗體：封閉完成后，TBST于室溫搖床洗滌5次×10 min，TBST將一抗稀釋至所需濃度，4 ℃搖床孵育過夜，TBST于室溫搖床洗滌5次×10 min，TBST將二抗稀釋到所需濃度，37 ℃搖床孵育1 h，室溫2 h。TBST室溫搖床洗滌3次×10 min，顯色觀察。

3 統計學方法

4 結果

4.1 異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因模型小鼠空間學習記憶能力的影響

與正常組比較，模型組學習成績反應期時間和錯誤次數顯著增加（P＜0.01），記憶成績潛伏期時間減少、錯誤次數顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組學習成績反應期時間和錯誤次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），記憶成績潛伏期時間增加、錯誤次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠跳臺實驗學習和記憶成績比較（±s）

表1 各組小鼠跳臺實驗學習和記憶成績比較（±s）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

學習成績 記憶成績組別 只數反應期/s 錯誤次數 潛伏期/s 錯誤次數正常組 10 13.30±3.16 2.20±2.39 24.90± 5.03 0.70±0.10模型組 10 21.63±2.56△△5.38±2.77△△5.63± 5.21△△5.75±0.92△△陽性藥組 10 12.10±4.81*2.90±3.70**11.50± 4.12*4.90±5.44**低劑量組 10 18.80±5.05**4.00±2.48**13.10± 6.85*1.70±4.50**中劑量組 10 17.10±1.14**3.20±3.65**15.60±10.82**1.85±7.24**高劑量組 10 15.60±4.44**3.00±2.57**18.00± 5.05**1.03±4.42**

4.2 異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因模型小鼠海馬CA1區RAGE表達的影響

用RAGE抗體免疫組織化學染色后，可以分辨小鼠海馬CA1區的陽性反應物，分布在神經元細胞膜和細胞質。與正常組比較，模型組RAGE陽性細胞平均密度和平均數量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組RAGE陽性細胞平均密度和平均數量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2、圖1。

表2 各組小鼠海馬CA1區RAGE蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠海馬CA1區RAGE蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數 平均密度 陽性細胞數正常組 10 75.17±7.82 8.16±7.13模型組 10 110.14±9.42△27.26±2.26△陽性藥組 10 76.23±6.33*10.27±4.16**低劑量組 10 78.12±5.24*13.13±2.54*中劑量組 10 70.27±7.54**11.15±3.13**高劑量組 10 54.48±6.45**9.12±3.12**

圖 1 各組小鼠海馬CA1區RAGE陽性表達病理形態（免疫組化染色，×100）

4.3 異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因模型小鼠海馬CA1區LRP1表達的影響

LRP1抗體免疫組織化學染色后，可以分辨小鼠海馬CA1區的陽性反應物，分布在神經元細胞膜和細胞質。與正常組比較，模型組小鼠海馬CA1區LRP1陽性細胞平均密度和平均數量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組陽性細胞平均密度和平均數量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表3、圖2。

表3 各組小鼠海馬CA1區LRP1蛋白表達比較（s）

表3 各組小鼠海馬CA1區LRP1蛋白表達比較（s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 只數 平均密度 陽性細胞數正常組 10 172.14±6.93 48.41±3.34模型組 10 104.28±8.43△23.15±4.21△陽性藥組 10 119.34±6.21*30.25±4.12*低劑量組 10 120.09±8.54*30.83±2.94*中劑量組 10 125.17±7.18**27.08±5.24*高劑量組 10 139.67±6.21**36.12±6.13**

圖 2 各組小鼠海馬CA1區LRP1陽性表達病理形態（IHC染色，×100）

4.4 異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因模型小鼠全腦RAGE蛋白表達的變化

各組在42 kD處有一個明顯的條紋，模型組條帶顏色加深；與模型組比較，異常黏液質成熟劑各劑量組條帶顏色變淺，表明蛋白表達減弱。結果見圖3。

圖3 各組小鼠全腦RAGE蛋白表達

4.5 異常黏液質成熟劑對APP/PS1轉基因模型小鼠全腦LPR1蛋白表達的影響

各組在70 kD處有一個明顯的條紋，模型組和正常組條帶顏色變化不顯著；與模型組比較，異常黏液質成熟劑各劑量組條帶顏色稍微變深，表明蛋白表達逐步增強。結果見圖4。

圖4 各組小鼠全腦LRP1蛋白表達

5 討論

AD是一種與年齡相關、不可逆的神經退行性疾病，初期呈現輕度認知功能障礙，最終發展為嚴重的記憶功能缺損。在疾病后期，抑郁或焦慮和易怒等精神癥狀出現。血腦屏障中的LPR1和RAGE與β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）生成和清除有關[2]。在AD患者和APP/PS1轉基因AD模型中，晚期糖基化終末產物受體RAGE在血腦屏障中的表達大幅上升，從而使更多的Aβ進入大腦內。而Aβ沉積可以刺激RAGE表達進一步增強，形成一個惡性循環。神經元和小神經膠質細胞與血管內皮細胞膜上RAGE及Aβ結合，引起神經元毒性、持久性的炎癥反應。LRP1為低密度脂蛋白受體相關蛋白屬LDL受體家族的多配體受體，LRP1可以在神經元、內皮細胞、膠質細胞等表達，不同細胞表達作用不同。在AD動物模型中腦內LRP1的嚴重缺失和血腦屏障受體相關蛋（RAP）基因的缺失均導致腦內淀粉沉積加倍[3]。已發現在AD患者和APP轉基因動物模型中，RAGE在血腦屏障中顯著上調，而LRP1下調，并與腦內Aβ聚集有關[4-5]。

目前治療AD藥物主要是通過增強膽堿能神經的功能發揮治療作用，可逆性地抑制乙酰膽堿酯酶對乙酰膽堿的水解，從而提高乙酰膽堿的濃度。維醫認為，大腦是濕寒性臟器，黏液質屬性也是濕寒，其中澀味黏液質是黏液之中混入黑膽質的異常體液，份量重、質地稠，作為大腦病理產物在大腦中沉淀，容易形成神經阻滯，從不同途徑和/或不同程度上影響破壞神經組織、影響細胞的正常生理功能，進而導致引起相應的神經功能障礙和AD等神經系統疾病[6]。

本實驗結果顯示，模型組小鼠海馬RAGE蛋白表達明顯增加，這與Hori O等[7]研究的AD患者腦內RAGE表達均顯著增高，RAGE能介導Aβ跨越血腦屏障進入腦實質的結果相似。AD病因包括APP、PS1基因的突變[8]，Aβ引起的神經元損害已被認可作為一種重要的病理特征，在研究和開發轉基因小鼠的過程中起十分重要的作用[9]。APP/PS1轉基因小鼠是使用最廣泛的模型之一。本實驗通過使用APP/PS1轉基因小鼠模型，以AD主要治療藥物多奈哌齊為陽性對照，以維吾爾醫學體液論為基礎，根據維吾爾醫學治療原則，以異常黏液質成熟劑作為實驗藥物進行干預。

實驗結果表明，異常黏液質成熟劑治療后各給藥組小鼠海馬CA1區RAGE陽性細胞數較模型組減少，異常黏液質成熟劑高、中劑量組陽性細胞平均密度明顯降低。比異常黏液質成熟劑各劑量組海馬CA1區表達的LRP1陽性細胞數明顯增加，高劑量效果最明顯，提示異常黏液質成熟劑可有效地改善神經細胞的損傷。Western blot結果顯示，給藥組轉基因小鼠腦內存在RAGE的表達下降，LRP1表達上調，最終改善APP/PS1轉基因小鼠的認知功能。

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Effects of Abnormal Phlegmatic Munziq on Ability of Learning and Memory and Protein Expressions of Brain Tissue RAGE and LRP1 of APP/PS1 Transgenic Mice Model of AD

Tayerjan Tursun1, Adilan Shalamu2, LAN Xi2, SUN Long-fei3, Nurmuhammat Amat1
(1. Traditional Uyghur Medicine College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. The First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 3. Traditional Chinese Medicine College , Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

ObjectiveTo investigate the effects of Abnormal Phlegmatic Munziq on ability of learning and memory, and protein expressions of brain tissue RAGE and LRP1 of APP/PS1 transgenetic mice model of AD; To discuss its mechanism of action.MethodsThree-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into 5 groups: model control group, positive control group, Abnormal Phlegmatic Munziq high-, medium-, and low-dose groups, 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/6J mice were chosen as normal control group. All administration groups received relevant medicine for successive 6 months. Then the changes in ability of learning and memory of mice were detected by Step-down test; protein expressions of LRP1 and RAGE were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the normal control group, the reaction time of learning grades and the mistake times increased, incubation of memory grades decreased and the mistake times increased in the model control group (P＜0.01); Compared with the model control group, the reaction time of learning grades and the mistake times decreased, incubation of memory grades increased and the mistake times decreased in all administration groups (P＜0.05, P＜0.01). Immunohistochemistry and Western blot results showed that compared with normal control group, the LRP1 expression decreased and RAGE increased in the model control group (P＜0.05);Compared with the model control group, the LRP1 expression decreased and RAGE increased in Abnormal Phlegmatic Munziq high-, medium-, and low-dose groups (P＜0.05，P＜0.01).ConclusionAbnormal Phlegmatic Munziq can improve ability of spatial learning and memory in APP/PS1 mice and regulate the expressions of RAGE and LRP1.

Abnormal Phlegmatic Munziq; APP/PS1 transgenic mice; spatial learning and memory; hippocampal CA1; RAGE; LRP1

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.011

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0043-05

2016-02-24）

（

2016-04-05；編輯：華強）

教育部新世紀優秀人才計劃（NCET-11-1073）

努爾買買提·艾買提，E-mail：Oglan1972@126.com