活血除痹湯對硬皮病小鼠皮膚血小板衍生生長因子A和轉(zhuǎn)移生長因子-β表達的影響

潘厚儒，陳曦，張潤田，徐國梅，段行武

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

活血除痹湯對硬皮病小鼠皮膚血小板衍生生長因子A和轉(zhuǎn)移生長因子-β表達的影響

潘厚儒1，陳曦1，張潤田1，徐國梅2，段行武1

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

目的觀察活血除痹湯對硬皮病小鼠皮膚血小板衍生生長因子A（PDGF-A）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達的影響，探討其可能的作用機制。方法30只小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥高、中、低劑量組，每組6只。除空白組外，其余各組小鼠均予皮內(nèi)注射鹽酸博來霉素0.1 mL，連續(xù)3周，建立硬皮病小鼠模型。第4～7周，空白組和模型組予等量蒸餾水灌胃，中藥高、中、低劑量組分別給予活血除痹湯44.8、22.4、11.2 g/（kg·d）灌胃，每日1次。觀察各組小鼠皮膚及肺組織病理學(xué)改變，HE染色測量皮膚厚度，免疫組化檢測皮損組織PDGF-A、TGF-β和Ⅰ、Ⅲ型膠原（COL-Ⅰ/COL-Ⅲ）的蛋白表達。結(jié)果模型組小鼠真皮明顯增厚，膠原纖維明顯增粗，并有炎性細胞浸潤；肺組織可見肺泡間隔增厚，有成纖維細胞形成并伴大量單核細胞浸潤；與模型組比較，中藥各劑量組皮膚厚度、真皮膠原纖維膨大增厚程度及肺泡間隔增粗程度均有所減輕。模型組PDGF-A、TGF-β、COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白表達均較空白組明顯增加（P＜0.01）；中藥各劑量組上述指標陽性表達均較模型組明顯降低（P＜0.01）。PDGF-A、TGF-β表達與COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表達呈正相關(guān)。結(jié)論活血除痹湯可能通過抑制PDGF-A、TGF-β的表達，抑制膠原表達和成纖維細胞的生成，達到治療硬皮病的作用。

硬皮病；活血除痹湯；膠原蛋白；血小板衍生生長因子A；轉(zhuǎn)化生長因子-β；小鼠

硬皮病皮膚增厚、硬化與內(nèi)臟纖維化與膠原纖維在細胞外基質(zhì)中過度增生、沉積有關(guān)。研究表明，血小板衍生生長因子A（PDGF-A）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）在膠原纖維的分化、增殖及代謝中扮演重要的角色[1-2]。活血除痹湯為臨床治療硬皮病硬化期經(jīng)驗方，由當歸四逆湯化裁而成。有研究顯示，當歸四逆湯對硬皮病硬化期患者療效確切[3-4]。本實驗觀察其對硬皮病硬化期模型小鼠皮膚TGF-β、PDGF-A表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雌性清潔級6周齡近交系Balb/c小鼠30只，體質(zhì)量約20 g，北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院清潔級動物實驗室，溫度（21±3）℃，濕度25%～35%，自然光線。

1.2 藥物與試劑

活血除痹湯（當歸10 g，白芍10 g，丹參15 g，川芎10 g，雞血藤30 g，桂枝10 g，杜仲10 g，黃芪15 g，秦艽15 g，防風(fēng)10 g，拳參15 g，豨薟草10 g），北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房，水煎，藥液濃度為4.48 g/mL；注射用鹽酸博來霉素，日本化藥株式會社，批號730342。

1.3 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS），北京邁晨科技有限公司；PDGF-A抗體、Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）抗體、Ⅲ型膠原（COL-Ⅲ）抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司；TGF-β抗體，英國Abcam；羊抗兔IgG/HRP試劑盒、羊抗小鼠IgG/HRP試劑盒、兔抗羊IgG/HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。抗敏脫毛機（廣州市有喜化妝品有限公司），電熱恒溫孵育箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司），低溫高速離心機（德國Sigma公司），顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和造模

30只小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥高、中、低劑量組，每組6只。實驗前1 d除去所有小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛。參照文獻[5-6]方法及預(yù)實驗結(jié)果，在小鼠背部脫毛區(qū)中央，空白組皮內(nèi)注射10 mmol/L PBS 0.1 mL，其余各組皮內(nèi)注射400 μg/μL鹽酸博來霉素0.1 mL，每日1次，連續(xù)3周。

2.2 給藥

中藥高、中、低劑量組予44.8、22.4、11.2 g/（kg·d）活血除痹湯灌胃，空白組和模型組予等量蒸餾水灌胃。給藥體積均為0.2 mL，每日1次，連續(xù)4周。

2.3 檢測指標

末次給藥后24 h脫頸處死小鼠，開胸切取肺葉，取皮膚約100 mg，福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。鏡下觀察皮膚和肺組織改變，觀察皮膚厚度、膠原纖維增生情況及血管變化。

2.4 HE染色

4倍目鏡下每只小鼠染色切片隨機選取6個視野拍照，Image-ProPlus6.0軟件測量真皮和表皮厚度，取其平均值。

2.5 免疫組化染色

組織固定，二甲苯脫蠟，100%乙醇洗去二甲苯，梯度乙醇水化，蒸餾水洗滌；抗原修復(fù)，PBS沖洗3次×2 min；內(nèi)源性過氧化物酶滅活，滴加1∶100一抗100 μL孵育，4 ℃冰箱過夜，次日取出，室溫復(fù)溫約30 min，PBS洗5次×3～5 min；滴加二抗Ⅰ，37 ℃恒溫孵育20 min，取出，PBS沖洗3次×2 min，滴加二抗Ⅱ，37 ℃恒溫孵育25 min，取出，PBS沖洗3次×2 min；DAB顯色，鏡下觀察；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下采集圖像，切片隨機選取10個視野。以Image-ProPlus6.0軟件分析陽性區(qū)域平均光密度（IOD）值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 活血除痹湯對模型小鼠皮膚厚度的影響

模型組皮膚厚度較空白組明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組皮膚厚度明顯降低（P＜0.01），高劑量組皮膚厚度降低最明顯（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠皮膚厚度比較（±s，μm）

表1 各組小鼠皮膚厚度比較（±s，μm）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與中藥高劑量組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) 皮膚厚度空白組 6 31.04±1.73模型組 6 112.00±5.27**中藥高劑量組 6 41.19±1.37##中藥中劑量組 6 54.19±1.37##△△中藥低劑量組 6 75.40±2.77##△△

4.2 活血除痹湯對模型小鼠皮損組織病理形態(tài)的影響

模型組真皮層較空白組明顯增厚，膠原纖維數(shù)量增加、增粗膨大，纖維間隙變窄，毛囊萎縮，真皮血管周圍和間質(zhì)內(nèi)有炎性細胞浸潤，血管壁明顯增厚，脂肪層減少甚至消失，皮膚附屬器明顯減少；中藥各劑量組真皮厚度及膠原纖維增粗膨大異常均有不同程度減輕，血管周圍炎性細胞浸潤程度有所緩解，中藥高劑量改變最明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠皮損組織病理形態(tài)（HE染色，×20）

4.3 活血除痹湯對模型小鼠皮膚血小板衍生生長因子A、轉(zhuǎn)化生長因子β和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的影響

鏡下可見小鼠皮損TGF-β特異性染色集中在毛囊周圍、細胞漿和血管壁周圍，模型組表皮、真皮厚度明顯高于空白組，真皮組織排列紊亂；中藥各劑量組皮損和真皮組織排列紊亂程度逐漸減輕。見圖2。空白組小鼠皮膚PDGF-A散在于毛囊周圍，呈輕度染色；模型組PDGF-A真皮層大量出現(xiàn)且呈強陽性反應(yīng)，皮膚組織排列紊亂；中藥各劑量組PDGF-A在真皮層中表達逐漸趨于空白組。見圖3。模型組有大量COL-Ⅰ沉積在真皮層，膠原堆疊明顯且排列紊亂；中藥各劑量組COL-Ⅰ堆疊情況減輕，特異性染色轉(zhuǎn)淡。見圖4。COL-Ⅲ在空白組表達明顯低于COL-Ⅰ，模型組可見COL-Ⅲ增生、堆疊、高度染色且排列紊亂，中藥各劑量組COL-Ⅲ增生、堆疊和染色逐漸好轉(zhuǎn)，見圖5。模型組TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量較空白組明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高各劑量組TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量明顯降低（P＜0.01），中藥高劑量組降低最明顯（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

圖3 各組小鼠皮損組織PDGF-A蛋白表達（免疫組化染色，×20）

4.4 相關(guān)性分析

皮膚厚度與TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠皮損組織COL-Ⅰ蛋白表達（免疫組化染色，×20）

圖5 各組小鼠皮損組織COL-Ⅲ蛋白表達（免疫組化染色，×20）

表2 各組小鼠皮損組織TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量比較（±s，IOD值）

表2 各組小鼠皮損組織TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ含量比較（±s，IOD值）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與中藥高劑量組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) TGF-β PDGF-A空白組 6 64.78±3.97 83.82±2.00 80.36±0.85 66.79±9.84 COL-Ⅰ COL-Ⅲ模型組 6 193.44±8.12**199.40±3.35**199.22±2.68**197.61±8.89**中藥高劑量 6 97.07±3.24##105.80±1.75##95.66±1.89##78.82±4.35##中藥中劑量 6 144.05±8.46##△△147.60±2.72##△△120.93±1.11##△△120.99±3.03##△△中藥低劑量 6 168.44±5.95##△△165.28±2.26##△△178.75±2.60##△△159.55±5.52##△△

5 討論

硬皮病屬中醫(yī)“痹證”“皮痹”“虛損”范疇，一般認為其主要由于脾肺氣虛，腎精不足，腠理不密，衛(wèi)外不固，風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲，阻于皮膚、肌肉、筋膜之間，以致營衛(wèi)不和，經(jīng)絡(luò)閉阻，氣血凝滯，痹塞不通而成。有研究顯示，中藥刺山柑總生物堿可通過調(diào)節(jié)小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制劑-1和白細胞介素4/干擾素-γ的失衡、減少COL-Ⅳ合成，改善硬皮病組織纖維化[7-8]。本實驗皮膚厚度和組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，造模部位皮損符合硬皮病硬化期的病理改變。造模部位皮膚厚度隨TGF-β及PDGF-A含量升高而增加，且皮膚厚度與COL-Ⅰ、COL-Ⅲ皮膚含量呈正相關(guān)。模型小鼠經(jīng)活血除痹湯干預(yù)后，其皮損厚度明顯變薄，膠原纖維增粗、紊亂情況有所改善；同時，皮損組織TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的含量明顯降低。活血除痹湯各劑量組干預(yù)硬皮病小鼠模型均有顯著效果，且高濃度作用最佳。

TGF-β是促進細胞外基質(zhì)（ECM）生成的重要因子之一，是誘發(fā)硬皮病膠原增生的重要物質(zhì)，并能通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物，阻止ECM的降解[9]。PDGF-A可促進成纖維細胞的增殖、活化并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化，并具有減緩ECM降解的功能。有研究顯示，硬皮病患者小毛細血管、毛囊周圍及特定皮膚細胞中PDGF-A含量升高，而在正常皮膚中含量極少[10]。另外，TGF-β可使成纖維細胞對PDGF-A的敏感性增加[11]，硬皮病患者皮膚及肺組織成纖維細胞中存在TGF-β、PDGF-A與PDGF受體α（PDGFR-α）的自分泌循環(huán)通路，提示在硬皮病發(fā)展過程中PDGF-A和TGF-β存在交互作用[12]。本研究結(jié)果顯示，小鼠皮膚厚度與TGF-β、PDGF-A、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的含量均呈正相關(guān)，提示活血除痹湯可能是通過抑制TGF-β和PDGF-A的含量，進而減少成纖維細胞的生成及分化、減少膠原生成、促進ECM代謝，達到治療硬皮病的作用。

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Effects of Huoxue Chubi Decoction on PDGF-A and TGF-β Expression in Skin of Scleroderma Mice Model

PAN Hou-ru1, CHEN Xi1, ZHANG Run-tian1, XU Guo-mei2, DUAN Xing-wu1
(1. Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo observe the effects of Huoxue Chubi Decoction on contents of PDGF-A and TGF-β in skin lesion of scleroderma mimicking mice models; To discuss its possible mechanism.MethodsThirty mice were randomly assigned into blank group, model group, TCM high-, medium-, low-dose group, with six mice in each group. Other than blank group, the rest of the 4 groups were given bleomycin-hydrocholoride 0.1 mL intradermal injection daily for 3 weeks to establish scleroderma mice models. From week 4 to 7, blank group and model group received gavage with equal amount of distilled water daily; TCM high-, medium-, low dosage group received gavage with Huoxue Chubi Decoction with different concentrations of 44.8, 22.4, 11.2 g/kg daily. The pathological changes in the skin tissue samples taken from each group were observed under microscope; the thickness of skin from each group was measured and the expression of PDGF-A, TGF-β, type-Ⅰ collagen (COL-Ⅰ) and type-Ⅲ collagen (COL-Ⅲ) were tested through immunohistochemical staining.ResultsCompare with blank group, the dermis tissue of model group was thicker, with the presence of thicker and greater number of collagen fibers, as well as infiltration of inflammatory cells. Compare with model group, thickness of skin and dermis collagen growth of TCM high-, medium-, low-dose group were milder varied by the concentration of the decoction. The result of immunohistochemical staining showed that the expressions of PDGF-A, TGF-β, COL-Ⅰ and COL-Ⅲ of modelgroup significantly increased than blank group (P＜0.01); the expression of the mentioned indicators were statistically significant lower in the TCM high-, medium-, low-dose group than model group; The expressions of PDGF-A and TGF-β showed a positive correlation with the amount of COL-Ⅰ and COL-Ⅲpresented in each group.ConclusionHuoxue Chubi Decoction can suppress collagen expression and fibroblast formation in skin lesion of scleroderma mice models by down regulating the expressions of TGF-β and PDGF-A, thus demonstrate its potential in scleroderma treatment.

scleroderma; Huoxue Chubi Decoction; collagen; platelet-derived growth factor A; TGF-β; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.012

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0048-05

2016-04-02）

（

2016-05-12；編輯：華強）

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項目（2013-JYBZZ-XS-189）

段行武，E-mail：xwduan@sina.com