黑靈芝多糖對丙烯酰胺誘導小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用

張路路，石 婷，朱夢婷，陳 奕?

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

黑靈芝多糖對丙烯酰胺誘導小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用

張路路，石 婷，朱夢婷，陳 奕?

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：研究黑靈芝多糖對丙烯酰胺（acrylamide，AA）所致的小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用。方法：構建AA誘導小腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）-6氧化損傷型，采用噻唑藍比色法檢測黑靈芝多糖對IEC-6氧化損傷的保護作用；同時測定細胞培養液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出量，以及測定細胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdelyde，MDA）水平。結果：與正常對照組相比，不同質量濃度的黑靈芝多糖對細胞增殖影響無顯著性差異。與模型（AA）組相比，不同質量濃度的黑靈芝多糖溶液能夠明顯減輕AA對細胞的毒害作用，提高細胞生存率，降低細胞培養液中LDH的釋放；降低MDA含量，提高細胞SOD和GSH-Px活性。結論：黑靈芝多糖可以通過提高細胞內抗氧化酶系的活性和抗氧化物質GSH-Px活性從而有效地減弱AA誘導的小腸上皮細胞氧化損傷。

黑靈芝多糖；丙烯酰胺；IEC-6；氧化損傷

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是人們廣泛接觸的一種重要工業化合物，最初作為合成聚AA的化學單體，廣泛應用于污水處理、造紙工業、醫藥、農藥和染料等多種行業[1]，是環境中潛在的有毒污染物。在2002年 4月，由瑞典國家食品管理局與斯德哥爾摩大學的研究人員首次在多種油炸、高溫烘烤食品中發現了AA，引起世界衛生組織、世界糧農組織、科學界和大眾的廣泛關注[2]。同時研究結果表明AA具有多種毒性，其中包括神經毒性、遺傳毒性、發育毒性、雄性生殖毒性等[3]。由于AA屬于一種水溶性的神經毒性物質，滲透性較強，人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收AA。AA在經口途徑隨食物進入人體后，在消化過程中可以快速到達腸道[4]，腸上皮是實現腸道消化、免疫、內分泌等功能的主要組織細胞，也是構筑腸道黏膜屏障的主要成分，由此可見腸上皮是AA毒性的主要靶目標[5]。然而目前AA對小腸細胞毒性的研究報道很少，且研究并不深入。已有的體內體外研究已證實AA可快速進入小腸細胞，可導致細胞內還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）濃度顯著下降，促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基的大量生成，使細胞內的氧化壓力急劇上升，從而抑制細胞的正常功能，導致細胞死亡或凋亡[5]。同時AA還能夠導致小鼠小腸細胞凋亡、肌層損傷、小腸壁和黏膜結構改變、消化吸收面積減少、吸收能力下降[6]。由此可知，AA可通過氧化應激產生大量ROS自由基并且能夠抑制機體內抗氧化酶的活性[7]，造成組織損傷[8]，引起細胞死亡[9-10]。

因此，探求能夠有效地抑制ROS自由基大量生成的天然產物，作為一種改善氧化應激的干預措施，有望成為預防和抑制AA導致的腸道氧化損傷的一種切實可行的方法。黑靈芝是我國重要的藥食兼用真菌資源，也是江西省的特色資源，具有較好的營養、保健、醫療價值。本實驗以黑靈芝為研究對象，分離純化得到黑靈芝多糖組分。通過體內體外研究表明黑靈芝多糖具有抗氧化防御能力[11-12]，能夠改善過氧化氫所誘導的氧化應激，具有增強免疫抗腫瘤的作用[13]。本實驗利用AA誘導小腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）-6細胞氧化應激損傷模型，探討黑靈芝多糖對IEC-6的保護作用，以期為黑靈芝多糖的充分應用與深度開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑靈芝采自江西贛州贛南靈芝基地；黑靈芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，GAP）由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室制備：采用水提醇沉提取粗多糖，然后采用不同濃度的NaCl溶液進行洗脫得到5 個級份，分別為GAP-FW、GAP-F0.1、GAP-F0.2、GAP-F0.5、GAP-F2，經高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測，其中GAP-F2純度＞98%[14]，用于后續實驗；大鼠IEC-6 上海酶研生物科技有限公司（來源于美國ATCC細胞庫）。

杜爾伯科改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 美國HyClone公司；胎牛血清 美國BI公司；噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium bromide，MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）及BCA（bicinchonininc acid）蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

二氧化碳培養箱 日本Toshiba公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；TGL216G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；全波長掃描式多功能讀數儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

細胞培養在含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，于37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養，細胞鋪滿瓶底80%以上，取對數生長期增殖活躍的細胞進行分組。

1.3.2 IEC-6氧化損傷模型的構建

[15]，采用MTT比色法檢測存活率。取對數生長期的IEC-6，以1×104個/mL的細胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃培養箱中培養24 h。倒掉培養基，加入不含血清的完全培養基。每孔按濃度梯度（終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/ L）加入AA。同時設置空白對照組（0.0 mmol/L），置于37 ℃培養箱中培養24 h。離心（室溫條件下1 500 r/ min）5 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗一次，每孔加入100 μL完全培養基，使MTT終質量濃度為0.5 mg/mL，置于培養箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內藍紫色結晶完全溶解后，使用酶標儀檢測490 nm波長處的光密度（OD）值。計算公式如式（1）所示。

1.3.3 MTT法檢測黑靈芝多糖對IEC-6增殖的影響

參考文獻[16]，將對數生長期的IEC-6，用胰蛋白酶消化成單層細胞，用新鮮DMEM培養基配制成單個細胞懸液，以1×104個/mL的細胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL。置于37 ℃培養箱中培養24 h。倒掉培養基，加入不含血清的完全培養基。每孔按質量濃度梯度（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）加入GAP-F2，同時設置空白對照組。置于37 ℃培養箱中培養20 h。離心（室溫條件下，1 500 r/min）5 min，PBS清洗一次，每孔加入100 μL完全培養基，使MTT終質量濃度為0.5 mg/mL，置于培養箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內藍紫色結晶完全溶解后，使用酶標儀檢測490 nm波長處的OD值。實驗重復3 次。另設空白孔，排除干擾。計算公式與式（1）相同。

1.3.4 黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6存活率的影響

取對數生長期的IEC-6，置于37 ℃培養箱中培養24 h。倒掉培養基，加入不含血清的完全培養基。將細胞分為7 個處理組，分別為空白對照組、 AA組、陽性對照組（N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）終濃度為10 mmol/L）、多糖氧化抑制組（使GAP-F2終質量濃度為20、40、80、160 μg/mL），每組10 個復孔；置于37 ℃培養箱中培養20 h后，1 500 r/min離心5 min，吸去培養基，更換不含血清的AA終濃度為5 mmol/L的完全培養基，其中空白對照組AA終濃度為0 mmol/L。置于37 ℃培養箱中培養4、8、16、24 h。離心（37 ℃、1 500 r/min）5 min，PBS清洗一次，每孔加入100 μL完全培養基，使MTT終質量濃度為0.5 mg/mL，置于培養箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清，每孔加入150 μL的DMSO溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內藍紫色結晶完全溶解后，使用酶標儀檢測490 nm波長處的OD值。計算公式與式（1）相同。

1.3.5 氧化損傷細胞培養液中LDH漏出量的測定

取對數生長期的IEC-6按1.3.4節方法分組，用AA損傷細胞16 h。1 500 r/min離心5 min，收集上清液，按試劑盒說明書步驟測定上清液中LDH的漏出量。

1.3.6 氧化損傷細胞內SOD、GSH-Px活性、MDA水平的測定

參考文獻[17]細胞處理在6 孔板內進行，取對數生長期的IEC-6按1.3.4節方法分組，用AA損傷細胞16 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min，收集細胞用冷PBS清洗，然后1 500 r/min離心5 min，收集細胞，加入細胞裂解液150 μL，混勻4 ℃孵育5 min。離心取上清液，按試劑盒說明書步驟測定細胞內SOD、GSH-Px活性以及過氧化物產物MDA水平

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 不同濃度AA對IEC-6存活率的影響

采用濃度為0.0（空白對照組）、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L AA處理IEC-6 24 h，構建氧化損傷模型，結果如圖1所示。

圖1 AA對IEC-6的氧化損傷Fig.1 Oxidative damage induced by AA of IEC-6

由圖1可知，采用1～20 mmol/L AA處理24 h，均能對IEC-6造成顯著損傷，考慮到AA造成的細胞存活率的半數致死量，以及損傷程度過于嚴重可能導致無法進行修復作用研究，因此本實驗選取5 mmol/L AA作為最佳誘導濃度，構建IEC-6氧化損傷模型，此時細胞存活率為46%。

2.2 不同質量濃度黑靈芝多糖對IEC-6增殖的影響

MTT實驗是檢測活細胞數量的常用方法。采用不同質量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）GAP-F2處理IEC-6 20 h，測定不同質量濃度GAP-F2處理IEC-6的毒性，篩選安全劑量范圍，結果如圖2所示。

圖2 黑靈芝多糖對IEC-6生長的影響Fig.2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on the growth of IEC-6

由圖2可知，在1～160 μg/mL劑量范圍內，GAP-F2均未對IEC-6造成顯著毒性，屬于安全范圍內。說明GAP-F2對IEC-6增殖沒有影響，不具有細胞毒性，因此在后續研究中，選擇不同質量濃度（20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）GAP-F2研究其對IEC-6氧化損傷的保護作用。

2.3 不同質量濃度黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6存活率的影響

表1 黑靈芝多糖對AA誘導的IEC-6氧化損傷的預防作用Table1 Preventive effect ofGanoderma attrruumm polysaccharides against AA-induced oxidative damage in IEC-6

由表1可知，AA處理不同時間后，與空白對照組相比，IEC-6存活率明顯下降（P＜0.01）。相反，不同質量濃度GAP-F2預處理20 h后，細胞存活率相對于AA組明顯增加，且黑靈芝多糖的保護效果一定程度上隨著質量濃度的增加而增強，呈現出一定的劑量-效應關系。由表1中結果可以發現80、160 μg/mL GAP-F2均能顯著地緩解AA造成的細胞存活率的降低（P＜0.01），與陽性對照組相比細胞存活率無顯著性差異。而20 μg/mL GAP-F2組在AA處理4、8、16 h后，黑靈芝多糖無顯著保護作用。由此可知40、80、160 μg/mL GAP-F2預處理可有效地抑制AA造成的IEC-6死亡。

2.4 不同質量濃度黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6釋放LDH的影響

圖3 黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6釋放LDH的影響Fig.3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on the release of LDH in IEC-6 with AA-induced oxidative damage

細胞在凋亡或者壞死過程中細胞膜的結構會遭到破壞，致使細胞漿內的酶釋放到培養液中。LDH水平在一定程度上能反映出細胞受損程度，因而常常作為判斷細胞氧化損傷程度的重要參數。通過檢測培養上清中LDH水平可以實現對細胞毒性的定量分析，從而反映出細胞的損傷程度。

不同處理組檢測出LDH漏出量如圖3所示，結果發現，與空白對照組相比，AA組中的LDH漏出量極顯著上升，表明AA可導致上皮細胞氧化損傷。與AA組相比，黑靈芝多糖組中LDH漏出量極顯著降低，而且160 μg/mL GAP-F2組與陽性對照組相比，細胞中LDH漏出量相當，這表明高劑量GAP-F2能顯著降低LDH漏出量。這些結果表明黑靈芝多糖可有效降低AA對IEC-6造成的氧化損傷，具有很強的保護作用，且呈劑量-效應關系。

2.5 不同質量濃度黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6中SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量的影響

在正常生理條件下，機體內ROS的生成和清除處于一種動態平衡，在內源性或外源性的有害刺激下，這種平衡將會遭到破壞，導致細胞內ROS的大量生成，超過機體抗氧化防御體系的清除能力，從而造成機體氧化應激損傷[18]。在機體受到氧化損傷的情況下，細胞中常見的內源性抗氧化物質主要包括：SOD、GSH-Px[19]。同時細胞在發生氧化應激時，細胞會發生脂質氧化。而MDA則是脂質過氧化的產物之一，可用作與檢測細胞中脂質氧化的水平[20-21]。

表2 黑靈芝多糖對氧化損傷IEC-6 SOD、GSH-Px活力、MDA水平的影響Table2 Effect off Ganoderma attrruumm polysaccharides on SOD and GSH activities and MDA content in IEC-6 with AA-induced oxidative damage

由表2可知，與空白對照組相比，AA組中的SOD活力顯著降低，而不同質量濃度的多糖均能有效緩解細胞中抗氧化酶含量的降低。GSH-Px在保護細胞免受自由基損傷的過程中起著關鍵作用，是細胞內主要的抗氧化酶，能夠反映出細胞內的抗氧化水平。與AA組相比，細胞內GSH-Px活性呈劑量依賴性顯著增加，結果表明黑靈芝多糖能夠抑制AA造成的細胞氧化損傷，提高細胞內抗氧化酶的活性。與空白對照組相比，AA組中MDA含量顯著增加；與AA組相比，黑靈芝多糖組中MDA含量顯著降低，且與陽性對照組相比效果相當，表明黑靈芝多糖可減輕AA引起的氧化應激。

3 討 論

氧化應激作為AA誘導細胞損傷的關鍵機制之一[22]。可刺激細胞產生過量的ROS自由基，破壞細胞膜的完整性，影響細胞的正常的功能，并降低細胞內抗氧化酶的活性，造成細胞內氧化壓力的上升，最終可導致細胞損傷，甚至細胞凋亡或死亡。而大鼠小腸隱窩IEC-6是腸道內外環境的界面，是實現腸道消化、吸收、免疫、內分泌等功能的主要組織細胞，也是構筑腸道黏膜屏障的主要成分。AA可通過多種途徑迅速到達腸道，由此可見，腸上皮是AA誘導細胞毒性的主要靶器官。有研究表明[23]，在腸道細胞氧化應激狀態下，小腸細胞會產生過量的有毒ROS代謝物，與此同時氧化應激還可抑制細胞內抗氧化酶活性，破壞細胞內抗氧化防御體系，造成小腸黏膜損傷。AA作為一種高溫食品加工過程中產生的一種潛在致癌物，許多研究者都致力于尋找可用于拮抗膳食中AA對機體損傷的天然活性成分，期望通過多種天然活性成分構建AA體內防護的第二道障，以膳食補充劑的形式緩解AA對人體的潛在危害，并從細胞信號轉導通路層面著手，闡明其具體保護機制。研究結果已表明，大量天然活性成分應用于AA對機體毒性的保護上，如葡萄果渣提取物[24]、藍莓及其提取物[25]、矢車菊素-3-葡萄糖苷[26]、橄欖油提取物[27]等均表明能夠在一定程度上緩解AA對機體造成的損傷。近年來研究發現，很多植物、真菌來源的多糖對生物來源的ROS具有顯著的清除和抑制作用，如黃芪多糖可清除過多的自由基，抑制炎癥因子釋放，發揮其腸道免疫保護作用[24,28]；枸杞多糖可提高機體抗氧化酶活力及清除過多自由基，對大鼠小腸缺血再灌注氧化損傷有明顯的保護作用[29]。而黑靈芝多糖則被證實在清除自由基功能方面尤其突出[30]。本研究就以黑靈芝多糖為研究對象，來確定其是否能夠提高機體的內源性抗氧酶活性，抑制脂質過氧化的發生，從而減緩或預防AA誘導的應激性氧化損傷發生，以期為后續研究提供理論基礎。

本實驗采用AA誘導IEC-6氧化損傷，構建氧化應激損傷模型。實驗中選用了5 mmol/L濃度的AA誘導IEC-6損傷24 h能夠顯著造成細胞氧化損傷，證實了實驗的可行性。實驗研究結果表明，AA組與空白對照組相比，細胞存活率以及LDH漏出量均顯著增加，說明腸上皮細胞受到顯著損傷，因此氧化應激損傷模型建立成功。與此同時，細胞在經過AA處理后，細胞中的抗氧化酶活性SOD、GSH-Px的活性顯著降低，用于評價細胞的脂質過氧化水平的指標MDA含量與空白對照組相比，AA組顯著增高。而不同質量濃度黑靈芝多糖的氧化抑制組能夠顯著提高細胞存活率、減少細胞培養液中LDH的釋放、降低細胞的MDA的水平、提高細胞中SOD和GSH-Px活性。

綜上所述，黑靈芝多糖對AA誘導的細胞氧化損傷具有保護作用，此作用可能與提高細胞內抗氧化酶活性有關。此研究能為緩解或抑制AA誘導的細胞氧化應激損失提供一定的理論依據，但本實驗結果僅限于細胞水平的體外實驗，對黑靈芝多糖在氧化應激損傷下對細胞保護的具體分子生物學機制及其在體內的抗氧化保護機制還有待進一步的深入研究。

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Protective Effect of Ganoderma atrum Polysaccharides on Oxidative Damage Induced by Acrylamide in IEC-6 Cells

ZHANG Lulu, SHI Ting, ZHU Mengting, CHEN Yi?
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective： To investigate the protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides (GAP) against oxidative injury induced by acrylamide (AA) in intestinal epithelial cells (IEC)-6. Methods： The MTT assay was used to evaluate the proliferation of IEC-6. After cultivation, the cells and culture medium were collected for determining the activities of lactate dehydrogenase (LDH), malondialdelyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and reduced glutathione peroxidase (GSH-Px). Results： GAP had no toxic effect on the cultured IEC-6 at the tested concentrations. Compared with the AA-treated group, GAP significantly attenuated AA-induced oxidative damage and increased cell viability by decreasing LDH activity and MDA content, and increasing SOD and GSH-Px activities in IEC-6 line. Conclusion： These results suggested that GAP showed a protective effect against AA-induced oxidative damage in IEC-6 through inhibiting lipid peroxidation, and increasing antioxidant system activity.

Ganoderma atrum polysaccharides; acrylamide; IEC-6; oxidative damage

10.7506/spkx1002-6630-201703028

TS201.4

A

1002-6630（2017）03-0170-06

張路路, 石婷, 朱夢婷, 等. 黑靈芝多糖對丙烯酰胺誘導小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(3)：170-175. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703028. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Lulu, SHI Ting, ZHU Mengting, et al. Protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides on oxidative damage induced by acrylamide in IEC-6 cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 170-175. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703028. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-25

國家自然科學基金地區科學基金項目（21467016）；全國優秀博士學位論文作者專項資金項目（201357）；江西省青年科學家培養對象計劃項目（20142BCB23005）

張路路（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：1126304817@qq.com

?通信作者：陳奕（1982—），女，教授，博士，研究方向為食品化學與分析、食品營養與安全、食品質量與安全。E-mail：chenyi-417@163.com