二穗短柄草鈣依賴型蛋白激酶BdCDPK4基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

韋淑亞，趙旭東，王會(huì)平，楊廣笑，何光源

(1.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，湖北 武漢 430074； 2. 科技部國際科技合作基地(基因工程)，分子生物物理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

二穗短柄草鈣依賴型蛋白激酶BdCDPK4基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

韋淑亞1，趙旭東2，王會(huì)平1，楊廣笑2，何光源2

(1.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，湖北 武漢 430074； 2. 科技部國際科技合作基地(基因工程)，分子生物物理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)因與小麥、大麥等有很高的同源性，作為新型禾本科模式生物吸引了越來越多的研究者。試驗(yàn)采用基因克隆技術(shù)分離了二穗短柄草BdCDPK4基因的編碼區(qū)序列，并采用生物信息學(xué)方法分析了該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的序列特征、結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果表明，分離了BdCDPK4基因 1 851 bp 的 cDNA 序列(GenBank 登錄號(hào)為 XM_003559516)，編碼區(qū)長度為 1 752 bp，編碼 583 個(gè)氨基酸，分子量為 64.78 ku，等電點(diǎn)為9.12，含有N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)、EF手型結(jié)構(gòu)、類似鈣調(diào)素等結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于葉綠體和液泡上。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，該蛋白與小麥TaCDPK19 蛋白的同源性最近。根據(jù)各物種間 CDPKs 蛋白的高同源性，結(jié)合小麥TaCDPK19基因被高鹽和小麥白粉病菌Blumeriagraministritici(Bgt)誘導(dǎo)，推測(cè)BdCDPK4基因也可能參與逆境脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在抗逆等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。

CDPKs；BdCDPK4；多序列比對(duì)；生物信息學(xué)分析

1982年CDPK第一次在豌豆(PisumsativumL.)中被發(fā)現(xiàn)[1]；1987年CDPK首次在大豆(GlycinemaxL.)中得到純化和鑒定[2]，從此CDPK受到越來越多的研究者的關(guān)注。目前許多植物如楊樹(PopulustremulaL.)、水稻(OryzasativaL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)等的CDPKs成員已經(jīng)被鑒定并分類。擬南芥34個(gè)CDPKs成員分為4個(gè)亞類，分布在5條染色體上[3]；目前水稻中已有31個(gè)CDPKs被鑒定[4-5]；楊樹中32個(gè)CDPKs被鑒定分布在除ⅩⅢ、ⅩⅦ、ⅩⅧ號(hào)以外的染色體上[6]。在禾本科植物中，二穗短柄草基因組最小，僅為272 Mb，染色體基數(shù)為5條。目前二穂短柄草的基因測(cè)序已經(jīng)完成，結(jié)果表明，二穂短柄草從小麥屬中形成，二穂短柄草與小麥兩者基因組相似度在95%以上，并且感染小麥的各種細(xì)菌均能感染二穂短柄草，因此，二穂短柄草可以作為研究小麥、水稻等作物的新型單子葉模式植物。

當(dāng)受到高鹽、高溫、寒冷等非生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)CDPKs也會(huì)特異性表達(dá)，以此調(diào)節(jié)非生物脅迫響應(yīng)過程。研究發(fā)現(xiàn)，玉米(ZeamaysL.)中ZmCDPK1和ZmCDPK1a可以激活與高鹽和干旱相關(guān)的啟動(dòng)子響應(yīng)脅迫，ZmCDPK1激酶區(qū)缺陷型突變體不再響應(yīng)干旱等脅迫[7]。水稻OsCDPK7過表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對(duì)高鹽、低溫及干旱的耐受能力[8-9]。水稻OsCDPK9過表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對(duì)干旱的耐受能力[10]。CDPKs參與多個(gè)ABA依賴型信號(hào)通路，擬南芥AtCDPK4和AtCDPK11參與磷酸化AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子的過程，啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，從而抵抗高鹽和干旱脅迫[11]。由此可見，CDPKs在植物抵抗非生物脅迫的信號(hào)通路中有著極為重要的調(diào)節(jié)作用。盡管CDPKs在擬南芥、水稻和玉米等植物中已經(jīng)得到系統(tǒng)的研究，但在新型的禾本科二穗短柄草里有關(guān)CDPKs的研究報(bào)道還很少。本研究旨在通過二穂短柄草BdCDPK4基因的克隆，應(yīng)用蛋白在線分析軟件對(duì)所克隆的二穗短柄草BdCDPK4基因所編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[12-13]，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究二穗短柄草BdCDPK4基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，對(duì)小麥和大麥等谷類作物的復(fù)雜基因組的功能研究也具有重要意義。

推薦理由:本書是趙麗宏2018年全新創(chuàng)作的長篇少兒小說。小說通過黑木頭曲折震撼的生命歷程，以及它與童童一家結(jié)下的跨越幾代人的情緣，描摹出親情和人與動(dòng)物之緣。忠誠、信任和愛——每一位與動(dòng)物相伴的人都會(huì)為之動(dòng)容；親情、守護(hù)和陪伴——每一個(gè)家庭都會(huì)更加珍視日趨衰老的親人。從記憶中延伸出來的溫暖和愛，將撫平所有的心靈疼痛。

1 材料與方法

1.1 材料

二穗短柄草(B.distachyon)二倍體近交系Bd21種子由華中科技大學(xué)中英聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

實(shí)驗(yàn)需測(cè)取同種激勵(lì)不同電場(chǎng)條件下經(jīng)減振器減振后的加速度衰減的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用型號(hào)為JZ-5激振器給減振器提供正弦力F，采用DH5299動(dòng)態(tài)信號(hào)采集器和GF-20型號(hào)的功率放大器對(duì)激振器的振幅A和頻率ω進(jìn)行控制以及采集各傳感器的數(shù)據(jù)，加速度傳感器型號(hào)是YJ9A的壓電傳感器；壓電力傳感器的型號(hào)為YFF-1。按照上述的實(shí)驗(yàn)器材以及實(shí)驗(yàn)想法設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖3，其中虛線框中的直流穩(wěn)壓電源和高壓放大器組成了直流穩(wěn)壓高壓電源，為后續(xù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)提供1000V的穩(wěn)定高壓。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

通過對(duì)栽培過程及倒伏情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，超稀植模式下，覆膜及不覆膜種植油菜根系生長都較發(fā)達(dá)，主根長度可達(dá)40 cm以上。結(jié)合實(shí)際情況，分析2種情況下抗倒伏能力差異可能是由于稀植模式下，油菜生長狀況較好，尤其是在結(jié)子后，植物地上部分重量增加較多，導(dǎo)致不穩(wěn)定。在覆膜的情況下，土壤的濕度和硬度較為穩(wěn)定，油菜基本能承受植株重量且不發(fā)生倒伏，但未覆膜植株相對(duì)覆膜植株相差不是特別大，掛果后植株較重，在正常情況下，該植株可以抵抗一般的風(fēng)力而不倒伏，但下雨后，由于未覆膜，雨水直接淋透土壤，使得油菜植株根系部分土壤十分松軟，結(jié)構(gòu)力減弱，對(duì)油菜植物尤其是上部較重的油菜植物支撐力不足從而發(fā)生倒伏。

選取生長狀態(tài)良好的Bd21幼苗進(jìn)行總RNA的提取，采用植物提取RNA試劑盒，液氮研磨，提取二穗短柄草葉片的總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)，將獲得的完整和質(zhì)量好的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，備用。

我們已經(jīng)知道，神經(jīng)元能傳遞疼痛信號(hào)，那我們又是靠什么來區(qū)分溫柔的撫摸和惡狠狠的拳頭的呢？答案是不同種類的神經(jīng)元。有些神經(jīng)元只在感受到輕微壓力時(shí)發(fā)出信號(hào)，令我們感到愉悅；另一些神經(jīng)元只對(duì)突發(fā)的劇烈感受有反應(yīng)，這就會(huì)讓我們感到疼痛。那么，問題又來了：為什么手指頭劃破一個(gè)小口子會(huì)那么痛？這是因?yàn)闃渫唬ㄉ窠?jīng)末梢）在人體內(nèi)的分布是不均勻的，而樹突分布最密集的地方就是我們的嘴唇和指尖。

2.1 二穗短柄草BdCDPK4基因的克隆

將小麥(TriticumaestivumL.)TaCDPK19、擬南芥AtCPK10、AtCPK30、玉米ZmCDPK30、水稻OsCPK9、楊樹PtCDPK25、PtCDPK26、谷子(SetaruaitalicaL.)SiCDPK30與BdCDPK4進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖2-A，目的蛋白與同源蛋白完全相同的氨基酸序列區(qū)域用黑色標(biāo)示，目的蛋白與同源蛋白的氨基酸序列相似區(qū)域分別用深灰色和淺灰色標(biāo)示。N端可變區(qū)、蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)、EF手型結(jié)構(gòu)、類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域分別用箭頭和橫線進(jìn)行標(biāo)示。使用MEGA5.0做進(jìn)化樹并進(jìn)行分析，如圖2-B，從進(jìn)化樹中可以看出，BdCDPK4與小麥TaCDPK19親緣關(guān)系最近，故將該基因命名為BdCDPK4。以上結(jié)果表明，我們所獲得BdCDPK4的確是二穗短柄草CDPK基因家族成員，并且與禾谷類小麥CDPKs有較高的同源性。

1.2.3 BdCDPK4蛋白進(jìn)化樹分析

利用數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行BLAST分析，使用生物軟件DNAMAN對(duì)BdCDPK4與其他物種中同源性較高的CDPKs進(jìn)行多序列比對(duì)分析。為了進(jìn)一步研究BdCDPK4與其他物種CDPKs之間的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA5.0作進(jìn)化樹進(jìn)行分析。

1.2.4 BdCDPK4蛋白序列生物信息學(xué)分析

據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，我國乳腺腫塊發(fā)生率逐漸增加，且患者的發(fā)病年齡逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，一定程度加重女性患者的心理負(fù)擔(dān)，影響患者身心健康，同時(shí)增加家庭以及社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。及早診斷患者病情，對(duì)于提高診治效果具有重要的臨床意義。

利用生物軟件和網(wǎng)上在線工具對(duì)BdCDPK4進(jìn)行生物信息學(xué)分析，主要包括理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位等方面的分析與預(yù)測(cè)。所使用的相關(guān)網(wǎng)站及軟件如下：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析(http://web.expasy.org/protparam/)；Hphob. / Kyte & Doolittle法分析蛋白質(zhì)疏水性(http://web.expasy.org/protscale/)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/；版本PSIPRED v3.3)；保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(http://plantsp.genomics.purdue.edu/index.html)；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http://swissmodel.expasy.org/)。用TargetP和 WoLFPSort 對(duì)BdCDPK4基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

2 結(jié)果與分析

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與目的基因的克隆

大腸埃希菌(E.coli) Top10 、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒(均購自天根生化科技(北京)有限公司)；pMD18-T simple vector、PrimeStar HS DNA Polymerase(購自大連TaKaRa公司)；植物總RNA提取試劑盒(購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司)、2×EsTaqMaster Mix(含染料)(購自北京康為世紀(jì)生物有限公司)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Fermentas公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

用分光光度計(jì)檢測(cè)所提取生長狀態(tài)良好的二穗短柄草Bd21幼苗的總 RNA，選擇吸光度比值(D260/D280)介于1.80～2.20的質(zhì)量良好的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用引物BdCDPK4-F/R 擴(kuò)增目的條帶。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖1所示，與預(yù)測(cè)條帶1 851 bp大小一致，委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)片段為 1 851 bp，通過序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與 NCBI 中登錄數(shù)據(jù)(XM_003559516)一致。

M Ⅲ，Marker Ⅲ圖1 BdCDPK4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agrose gel electrophorosis of BdCDPK4 PCRproducts

2.2.1BdCDPK4基因的同源性分析

鬼子隊(duì)長對(duì)燈草老爹的解釋深信不疑，豎起大拇指說：“你的老頭，專家的有！”回轉(zhuǎn)身，一把揪住刁德恒的衣領(lǐng)，“刁，你的八格牙路，死啦死啦的！”

利用數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)得到了目的基因BdCDPK4的全長cDNA序列信息，根據(jù)序列信息，利用生物軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(在目的基因開放閱讀框兩端區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)基因特異性引物)，并由武漢擎科公司合成。PCR所用的引物序列：BdCDPK4(Forward: 5’ -GGCAAGGAACGTCGTCCCATACA- 3’，Reverse: 5’- CCAAGCATCGCACATTGACCAGTT -3’)。基因克隆的PCR反應(yīng)體系為2×GC Buffer 10.0 μL，dNTPs mix 1.6 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Primer storase 0.2 μL，CDNA模板0.5 μL，ddH2O 5.7 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2% (m/V)瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

2.2.2 BdCDPK4蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性分析

堂妹坐在沙發(fā)上，看見我只是略帶笑容，我將紅包遞給她，單在心中矛盾，做不出任何禮儀動(dòng)作，她連忙用手推開：“我怎么敢收你的禮物呢？姐姐！”我突然愣在那里，于是和她一起坐著品嘗魚肉。她也說不出什么話，不住地打量我。按照家族制度，我向她敬了杯酒，覺得很不自在。她點(diǎn)了點(diǎn)頭，臉上現(xiàn)出平和的表情，動(dòng)著嘴唇，向大人們匯報(bào)工作情況。她對(duì)我父親的態(tài)度很殷勤，對(duì)我也很恭敬地說道：“請(qǐng)吃。”我小心翼翼地吃著菜肴，原本一直彼此冷淡的心在這一刻終于可以驗(yàn)證了，我和堂妹之間確實(shí)筑起了一堵厚厚的墻。

A， BdCDPK4多序列比對(duì)；B， BdCDPK4進(jìn)化樹分析A， Protein sequences alignment of BdCDPK4; B， Phylogenetic tree analysis of BdCDPK4The accession numbers of these known proteins in GenBank are as follows: TaCDPK19 (ABY59015.1) from Triticum aestivum; AtCPK10 (NP_564066.2)， AtCPK30 (NP_177612.2) from Arabidopsis thliana; OsCPK9 (NP_001050944.1) from Oryza sativa; PtCDPK25 (XP_002318616.1)， PtCDPK26 (XP_002322129.1) from Populus tremula; SiCDPK30 (XP_004982142.1) from Setarua italica; ZmCDPK30 (XP_008644596.1) from Zea mays圖2 BdCDPK4(XP_003559564.1)多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析Fig.2 Protein sequences alignment of BdCDPK4 and the phylogenetic tree analysis

2.2 BdCDPK4蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析

采用網(wǎng)上在線工具(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)BdCDPK4目的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行在線分析后，BdCDPK4蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為64.78 ku，分子式為C2855H4559N839O842S21，總原子數(shù)為9 116，理論等電點(diǎn)為9.12，脂肪指數(shù)為77.50，不穩(wěn)定指數(shù)為37.86，為穩(wěn)定蛋白。按照Hphob. / Kyte & Doolittle法分析該蛋白的疏水性，分析顯示該蛋白質(zhì)總平均親水性系數(shù)為-0.467(正值為疏水蛋白，負(fù)值為親水蛋白)，因此為親水蛋白，蛋白質(zhì)序列疏水性詳細(xì)分析結(jié)果如圖3。

新課程改革十分注重理論知識(shí)和現(xiàn)實(shí)生活相結(jié)合，因而教師在開展作文教學(xué)時(shí)，需要結(jié)合學(xué)生已有的生活經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)內(nèi)涵，在此基礎(chǔ)上為其建立生活化學(xué)習(xí)情境，促使學(xué)生在情境中發(fā)現(xiàn)能運(yùn)用到作文中的寫作素材。

2.2.3 BdCDPK4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括：α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-strand)、β-轉(zhuǎn)角(β-turn)、無規(guī)則卷曲(random coil)，其中α-螺旋、β-折疊較為常見。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析有助于了解其空間結(jié)構(gòu)。采用網(wǎng)上在線工具(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對(duì)BdCDPK4進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白激酶所含的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型中無規(guī)則卷曲及α-螺旋為主要組成部分，結(jié)果如圖4。

2.2.4 BdCDPK4的結(jié)構(gòu)域分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域蘊(yùn)含著遺傳進(jìn)化信息，結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)可以深入了解蛋白質(zhì)的特性，也為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供重要的信息。對(duì)于激酶蛋白，結(jié)構(gòu)域特性與功能密切相關(guān)。采用網(wǎng)上在線工具(http://plantsp.genomics.purdue.edu/index.html)對(duì)BdCDPK4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，BdCDPK4蛋白激酶中包含4個(gè)EF-hands結(jié)構(gòu)域、蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、脂多糖激酶家族、ATP結(jié)合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活區(qū)、預(yù)測(cè)跨膜區(qū)等結(jié)構(gòu)域，各個(gè)結(jié)構(gòu)域的分布情況及對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如圖5。

采用網(wǎng)上在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)BdCDPK4目的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行在線分析后，結(jié)果如下：BdCDPK4基因ORF為1 752 bp，共編碼583個(gè)氨基酸殘基，它含有丙氨酸殘基(Ala)61個(gè)，含量最高(10.5%)；色氨酸殘基(Trp)5個(gè)，含量最低(0.9%)；不含吡咯賴氨酸殘基(Pyl)和硒半胱氨酸殘基(Sec)，BdCDPK4的氨基酸組成及百分比如表1。

在充分利用砷資源的同時(shí)，應(yīng)積極開發(fā)含砷廢渣的處理新技術(shù)，為砷及其無機(jī)化合物的污染治理開辟新的途徑。同時(shí)探索適宜的砷處理新工藝，對(duì)含砷廢渣進(jìn)行綜合治理及利用，以高價(jià)值形式（如砷金屬單質(zhì)）回收砷渣中的砷資源, 將是處理含砷廢渣研究的新方向［6］；除砷技術(shù)也將會(huì)沿著多種除砷劑聯(lián)合同步使用，幾種除砷方法結(jié)合處理的方向發(fā)展。

表1 BdCDPK4的氨基酸組成及百分比

Table 1 The amino acid composition and percentage of BdCDPK4

氨基酸殘基Aminoacid個(gè)數(shù)Number含量Content/%氨基酸殘基Aminoacid個(gè)數(shù)Number含量Content/%Ala6110.5Lys335.7Arg539.1Met152.6Asn122.1Phe203.4Asp366.2Pro447.5Cys61.0Ser376.3Gln172.9Thr264.5Glu406.9Trp50.9Gly376.3Tyr142.4His152.6Val467.9Ile183.1Pyl00Leu488.2Sec00

圖3 BdCDPK4親水系數(shù)分析Fig.3 The hydrophilicity coefficient of BdCDPK4

2.2.5 BdCDPK4的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

西方女性主義理論在早期要求男女平權(quán)(兩性要在政治、法律、軍事、經(jīng)濟(jì)、職業(yè)和受教育等方面享有同等的權(quán)利和機(jī)會(huì))的發(fā)展階段之后，逐步向縱深領(lǐng)域推進(jìn)，進(jìn)一步要求對(duì)既成的社會(huì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行批判，認(rèn)為男女之間的社會(huì)分工與角色安排(內(nèi)/外、公/私)并不是由兩種再生產(chǎn)的區(qū)別與兩性生理差異所決定的，而是由男性主導(dǎo)的社會(huì)建構(gòu)的結(jié)果，是特定的經(jīng)濟(jì)、文化環(huán)境的產(chǎn)物。基于上述視角，儒家多被置于女性主義的對(duì)立面，被當(dāng)作結(jié)構(gòu)性歧視、壓迫女性的根源或者幫兇。

我們?cè)赬-ray衍射結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，沒有該蛋白的真實(shí)測(cè)定結(jié)構(gòu)，因此采用網(wǎng)上在線工具(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模，預(yù)測(cè)BdCDPK4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，BdCDPK4以人CAMK4三級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，成功建立的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，如圖6所示，該蛋白主要由 α -螺旋和無規(guī)則卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.2.6BdCDPK4基因編碼蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)

兩種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白主要位于葉綠體和液泡上，位于細(xì)胞核或作為細(xì)胞骨架的可能性較小。綜合兩種分析結(jié)果，該基因編碼的蛋白質(zhì)可能主要在葉綠體或液泡中發(fā)揮作用。

圖4 BdCDPK4蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The predicted secondary structure of BdCDPK4

3 討論

利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲得目的基因cDNA序列信息(XM_003559516)，將其命名為BdCDPK4，RT-PCR擴(kuò)增后將目的基因構(gòu)建至pMD18-T Simple載體上。通過BdCDPK4與小麥、水稻、楊樹、擬南芥、谷子和玉米中同源性較高的CDPKs進(jìn)行多序列比對(duì)及進(jìn)化分析。多序列比對(duì)結(jié)果表明，該蛋白具有CDPK家族特征如N端可變區(qū)、Ser/Thr蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域、自抑制區(qū)、EF手型結(jié)構(gòu)、類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，BdCDPK4與小麥TaCDPK19親緣關(guān)系最近。這些結(jié)果表明，我們所克隆到的BdCDPK4是二穗短柄草CDPK基因家族的一個(gè)成員。前期研究表明，小麥TaCDPK19基因可被高鹽和小麥白粉病菌Blumeriagraministritici(Bgt)所誘導(dǎo)[14]，推測(cè)BdCDPK4基因也可能參與逆境脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在抗逆等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。

圖5 BdCDPK4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析Fig.5 Prediction domain analysis of BdCDPK4

圖6 BdCDPK4蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和BdCDPK4預(yù)測(cè)模型Fig.6 The predicted tertiary structures of BdCDPK4 and prediction model of BdCDPK4

通過對(duì)BdCDPK4基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可知該蛋白激酶相對(duì)分子量大小為 64.78 ku，等電點(diǎn)為9.12，編碼583個(gè)氨基酸殘基以及含量組成百分比，該蛋白為親水蛋白，較為穩(wěn)定；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，α-螺旋及無規(guī)則卷曲是該蛋白激酶的主要組成部分；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)包含CDPK家族特征如N端可變結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)激酶催化區(qū)、自抑區(qū)和含有4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)的類似鈣調(diào)素區(qū)域。除此之外，通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)還可以看到，該蛋白質(zhì)序列中可能存在的特有區(qū)域如推測(cè)目的蛋白所具有的跨膜區(qū)及定位信息；在X-ray衍射結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)該蛋白激酶的真實(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此采用同源建模法以人CAMK4三級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，成功建立了三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示，ACPK1定位在細(xì)胞膜和葉綠體上[15]。用TargetP和 WoLFPSort兩種軟件預(yù)測(cè)BdCDPK4基因編碼的蛋白質(zhì)可能主要在葉綠體或液泡中發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析有助于了解BdCDPK4蛋白激酶的功能及其行使生物學(xué)功能的機(jī)制，對(duì)下一步BdCDPK4激酶蛋白的功能研究有重要意義。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Cloning and encoding protein bioinformatics analysis ofBdCDPK4 fromBrachypodiumdistachyon

WEI Shuya1， ZHAO Xudong2， WANG Huiping1， YANG Guangxiao2， HE Guangyuan2

(1.InstituteofAppliedBio-technology，CollegeofBiologicalEngineering，WuhanPolytechnic，Wuhan430074，China; 2.TheGeneticEngineeringInternationalCooperationBaseofMinistryofScienceandTechnology，KeyLaboratoryofMolecularBiophysicsofChineseMinistryofEducation，CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongUniversityofScience&Technology，Wuhan430074，China)

Brachypodiumdistachyon， the genome of which shares high homology with wheat and barley， has been used as the new model species ofGramineae. In order to clarify the structure and function ofBrachypodiumdistachyonCDPKs gene， the coding region sequence (CDS) ofBdCDPK4 gene ofBrachypodiumdistachyonwas isolated， and its character， structure and function were analyzed by bioinformatics methods. The results showed that 1 851 bp cDNA (GenBank ID: XM_003559516) of coding sequence ofBdCDPK4 gene included the complete 1 752 bp CDS， coded 583 amino acids， and located on chloroplast and vacuole. The molecular weight and isoelectric point of BdCDPK4 protein were 64.78 ku and 9.12， respectively. BdCDPK4 protein contained several domains including N-variable domain， kinase domain， autoinhibitory domain， EF-hands and CaM-like domain. Phylogenetic analysis results suggested that BdCDPK4 protein had high homology with wheat TaCDPK19.TaCDPK19 were induced by high salt and white powderBlumeriagraministritici(Bgt). BdCDPK4 protein may participate in the regulation of signal transduction pathways under stresses according to the homologies of protein domain among all species. Taken together， our data could establish a good foundation for studying the biological functions ofBdCDPK4 gene.

CDPKs; BdCDPK4; multiple sequence alignment; bioinformatics analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.23

2016-10-01

高校博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20120142110075)；湖北省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(B2016581)；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2009B210005)；武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)博士科研基金(2016BS001)

韋淑亞(1979—)，女，湖北武漢人，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail: weishuya1011@126.com

Q949.71+4.2

A

1004-1524(2017)02-0345-08