中藥肝毒性研究方法技術的新進展及其應用

宋捷+鐘榮玲++夏智++吳豪++仲青香++張振海+韋英杰++石子琪++封亮+賈曉斌

[摘要]中藥肝毒性問題受到了日益廣泛的重視。目前，肝細胞系、亞細胞、三維培養、模式動物等體內體外模型在中藥肝毒性的篩選中發揮著重要作用。隨著現代系統觀和整體論的引入，基因組學、蛋白質組學、代謝組學以及網絡毒理學等新方法開始逐步應用于中藥肝毒性標志物挖掘和肝毒性預警等方面。該文通過總結近年來中藥肝毒性研究領域的成果，分析和探討其中存在的主要問題，提出具有中醫藥特色的“結合病/證模型和網絡毒理學的中藥量效毒關系研究”的新思路，同時也對該課題組開展的淫羊藿潛在肝毒性的初步研究進行了概述，希望能為中藥肝毒性的評價方法和技術指導原則提供理論基礎，推動中藥肝毒性研究體系的發展與完善。

[關鍵詞]中藥肝毒性；病/證模型；量效毒；網絡毒理學；淫羊藿

肝臟是人體最大的“加工廠”，承擔著生物合成、代謝轉化以及分泌排泄等重要功能。藥物進入體循環后，將經過肝臟代謝，因此肝臟是藥源性損傷的主要靶器官之一。北京大學第一醫院王貴強教授[1]指出，403%的藥物性肝損傷為中草藥所致。何首烏、菊三七、補骨脂、番瀉葉、大黃等臨床常用中藥都已經被證實具有一定的肝毒性，重視中藥肝毒性已是當務之急。

2010年版《中國藥典》一部收載了中藥材及飲片2 165種，其中標有毒性的只有83種，其中大毒10種，有毒42種，小毒31種。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”幾乎全部指的是急性毒性；古人對于藥物的慢性毒性認識，是一個薄弱環節，不過這也是由時代的局限性所導致的。現階段臨床上治療心腦血管疾病和骨質疏松等疾病的中成藥都需要長期服藥，這勢必對中藥的安全性評價提出了更高的要求。因此，有必要對部分典型中藥的安全性進行再評價，對中藥的急性毒性、亞慢性毒性以及長期毒性有一個更為客觀和科學的認識，明確其臨床使用的安全窗；建立符合中醫藥特點的毒性評價體系，為中藥的臨床用藥提供參考。

傳統的毒理學研究通常以動物模型作為基礎，實驗周期較長，成本頗高。國際上常規的毒理學研究終點均因靈敏性、穩定性和特異性較差無法成為肝毒性早期診斷的標準。現有的臨床前體外實驗和體內實驗的整體毒性預測率只有71%，有近30%的藥物毒性是現有的臨床前實驗方法無法預測的。而隨著分子生物學和現代分析技術的發展，越來越多的新技術和新模型已用于肝毒性的研究中，如干細胞誘導分化的肝細胞及亞細胞模型（快速、經濟、直觀地反映出藥物對細胞及細胞器的影響），斑馬魚模型（檢測藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄過程），三維培養模型（模擬肝臟細胞的空間結構并維持代謝酶的活性），毒理基因組學，毒理蛋白質組學（利用基因芯片和質譜聯用技術找出新的生物標記物，構建肝毒性數據庫），以上肝毒性檢測手段的涌現極大的豐富了中藥肝毒性評價體系的內涵，有助于進一步揭示中藥肝毒性的機制，從而實現中藥肝毒性的早期預警。鑒于此，筆者將針對近5年來國內外肝毒性研究體系的進展進行綜述和分析。

1中藥肝毒性評價的新模型及其應用

11常見的肝毒性評價細胞模型

常見的肝毒性篩選細胞系主要有人原代肝細胞，HepG2，L02，hiHeps，HepaRG細胞系等（表1）。HepG2細胞是最具有代表性和最常用的細胞系，細胞表面表達有豐富的IGFII受體，但是在標準培養條件下，細胞中功能性CYP450酶活很低，幾乎檢測不到。趙筱萍等[2]采用二乙酸熒光素熒光標記法在HepG2細胞模型上篩選木香中的肝毒性組分，結合GCMS聯用技術，發現木香中所含的去氫木香內酯、珊塔瑪內酯、瑞諾木烯內酯、α木香醇和欖香醇具有一定的肝毒性；L02細胞是一種正常人胚胎肝細胞，能夠傳代培養，常用作化合物肝臟毒性的體外研究模型。Lin等[3]通過測定L02細胞的活力，LDH滲漏率，酶活力，并結合UPLCQTOFMS技術，辨析出何首烏的肝毒性主要和蒽醌類以及大黃素等密切相關；hiHeps細胞是由人胚胎成纖維細胞分化而來，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代謝酶的活力和新鮮分離的肝原代細胞接近[4]；HepaRG細胞由人肝臟細胞分化而來，兼具肝細胞和膽管上皮細胞的特性，功能酶（CYP450酶，內質網酶，ABC轉運蛋白）相對完整，具有雙向分化能力。吳宇等[5]運用6種聯合探針標記HepaRG細胞，雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環酮等藥物的毒性充分體現，氧化應激、線粒體損傷、內質網應激以及鈣穩態等指標的靈敏度也高于hiHeps，HepG2和L02細胞，提示HepaRG可作為高內涵細胞組學體外模型進行藥物肝毒性篩選。

12干細胞誘導分化的肝細胞模型

121人胚胎干細胞模型由人胚胎干細胞誘導分化的肝細胞（human embryonic stem cellderived hepatocytes，hESCHep）建立的肝毒性評價體系，具有實驗周期短、用藥量少和有效避免種屬差異等優點。hESC誘導分化3周即形成均一的、純度較高的肝樣細胞，具有肝細胞典型的形態結構并且可以檢測到CYP450酶、有機陰離子轉運多肽1B1、消除轉運蛋白BSEP以及肝細胞特異性蛋白，如胞內酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表達[67]。目前，該技術僅被少數實驗室掌握，價格不菲，但其為肝毒性評價體系的完善提供了一個全新的方向。

122人多潛能干細胞模型誘導人多潛能干細胞分化成肝細胞（human induced pluripotent stem cellsderived hepatocytes，hiPSCHep），用凝膠固定培養，并將其與鼠胚胎成纖維細胞（3T3J2）、基質膠共培養建立微型圖像化共培養平臺（iMPCC），該體系可促進hiPSCHep的成熟并使其壽命延長至4周。hiPSCHep可應用于肝毒性的預測以及肝極性、白蛋白含量、P450酶活的檢測[8]。Sullivan團隊[9]誘導hiPSCs分化出具有肝臟功能的人肝內胚層，發現其可以用于藥物毒性的篩選，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等[10]建立了hiPSCHep的三維球體培養體系（3D hiPSCHep），采用WST8法檢測肝毒性藥物對細胞活力的影響，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等藥物作用后，3D hiPSCHep組的細胞活力均明顯低于3D HepG2組，提示該模型的靈敏度要優于3D HepG2模型，更適用于肝毒性的早期篩選。

13亞細胞——高內涵分析

細胞經毒物作用受損或死亡時，其內部則表現為細胞器的損傷或病變，如線粒體、溶酶體、內質網等細胞器的損傷。熒光成像技術和高內涵分析（high content analysis，HCA）在亞細胞水平的篩選中應用日益廣泛[11]。目前HCA能夠實時、動態監測體外肝細胞毒性的多個參數、毒理學機制相關的多個重要的標志分子，主要包括細胞及亞細胞形態與數量、線粒體膜電位、氧化應激及DNA損傷，是評估和預測候選藥物肝毒性的高效手段。Fu等[12]利用分離的大鼠線粒體和雷公藤甲素（triptolide，TP）共同孵育，發現TP可濃度依賴性的誘導線粒體的腫脹，增加線粒體滲透性，最終導致線粒體損傷。Wang等[13]運用4種探針（羅丹明123，Hoechst33342，表1常見的肝毒性評價模型

Table 1Hepatotoxicity evaluation models

體外模型優點缺點人原代肝細胞較好的體內外相關性，具有完整的代謝酶表達系統，適用于酶誘導實驗分離復雜費時，存活時間短，部分CYP450 亞酶的表達量丟失，無法維持肝細胞的極性和代謝功能HepG2最具有代表性和最常用的細胞系，易于培養CYP450酶活很低，幾乎檢測不到L02是一種正常人胚胎肝細胞，具有典型的肝細胞形態學特征，常用于檢測細胞活力、LDH滲漏率酶表達量低而且難于誘導hiHeps來源于人胚胎成纖維細胞，有成熟肝細胞的特性，代謝酶的活力和新鮮分離的肝原代細胞接近，兼具膽汁排泄的功能僅表達出部分的酶亞型；價格昂貴，難以獲得HepaRG靈明度高，可進行肝毒性高內涵篩選，功能酶表達完整，雙向分化能力細胞培養基較為特殊，價格不菲hESCHep實驗周期短、用藥量少、避免種屬差異，可以檢測到CYP450酶、有機陰離子轉運多肽1B1、消除轉運蛋白BSEP以及肝細胞特異性蛋白的表達hESC技術仍存在瓶頸，且僅被少數實驗室掌握hiPSCHep可應用于肝毒性的預測以及肝極性、白蛋白含量、P450酶活的檢測誘導分化培育出的肝細胞只有少數實驗室可以完成，價格不菲亞細胞（高內涵分析）實時、動態監測體外肝細胞毒性的多個參數、毒理學機制相關的多個重要的標志分子檢測敏感性和熒光探針對細胞活性的影響等方面有許多有待解決的技術難題精密肝切片包含肝組織內的所有類型的細胞，維持了肝腺泡功能和結構的完整性，在生化和生理功能上與活體肝相似，可在早期快速、高效的識別藥物改變脂質代謝以及膽汁酸淤積藥物不容易滲透到切片的內部，而且切片中心的細胞容易壞死；切片用的儀器很昂貴“三明治”模型同時擁有肝細胞形態和膽管的網絡狀結構，維持外排轉運蛋白的功能性表達，可檢測到白蛋白、纖維蛋白原、轉鐵蛋白和尿素的表達原代肝細胞存活時間較短凝膠包埋肝細胞模型模擬體內細胞間微環境，保證代謝功能的長期維持肝細胞長期、高密度、高活性的培養方法有待進一步的改進微型中空纖維生物反應器細胞生長密度高、抗剪切力強、細胞活性好、細胞培養時間延長，合成產物易于提取，其中凝膠可為肝細胞提供三維立體支持作用生物反應器的結構和材料有待進一步優化斑馬魚模型幼魚魚體透明，可直接觀察肝臟顏色、大小、膽汁淤積情況；肝臟中有許多與哺乳動物同源的脂質代謝酶，包括HMGCoA合成酶、裂解酶幼魚給藥方式多為藥浴，和臨床劑量沒有直接的換算關系

宋捷等：中藥肝毒性研究方法技術的新進展及其應用碘化丙啶，mitotracker）聯合標記HepG2細胞，研究4種中藥注射液的肝毒性。使用HCA技術以及熒光顯微成像快速、敏感、高效的區分出了一種可能引起線粒體損傷的中藥注射液（Fufang Kushen），所得結論和小鼠的亞急性毒性試驗結果一致。肖小河團隊[14]采用HCA二重探針標記法，檢測何首烏與茯苓、甘草、三七在肝竇內皮細胞上的配伍減毒情況，研究發現何首烏對肝竇內皮細胞的損傷呈劑量依賴性，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七都有顯著的減毒作用。其中，何首烏配伍茯苓減毒的效果較好，甘草次之，三七稍差。

14三維培養模型

141精密肝切片精密肝切片（precisioncut liver slice，PCLS）技術是介于器官與細胞水平之間的體外培養技術，可包含肝組織內的所有類型的細胞，維持了肝腺泡功能和結構的完整性，在生化和生理功能上與活體肝相似，近年來已應用于肝毒性的研究。PCLS模型可以在早期快速、高效的識別藥物改變脂質代謝以及膽汁酸淤積的機制。Mukazayire等[15]使用PCLS模型簡單、快速的區分出了3種致肝毒性的盧旺達草藥，提示PCLS可用于大樣本的肝毒性篩選研究。Vatakuti等[16]通過大鼠PCLS技術研究了四氯化碳的肝毒性，運用微陣列分析監測mRNA的早期變化、轉基因組學實驗測定αB晶狀蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達，最終發現了四氯化碳誘導肝纖維化的早期標志物。回連強等[17]將不同濃度的野百合堿與肝切片共同孵育24 h后，乳酸脫氫酶（LDH）的含量顯著上升，蛋白水平下降，表明野百合堿會誘發一定的肝毒性。Szalowska等[1819]對具有潛在肝毒性藥物進行了篩選，用四環素、丙戊酸、碘胺酮與小鼠PCLS共同孵育，經DNA微陣列基因轉錄分析發現碘胺酮和丙戊酸是過氧化物酶體增殖物激活受體PPARα/（β/δ）/γ的激動劑。

142“三明治”模型通過循環灌流法分離大鼠原代肝細胞，將其置于雙層膠原之間培養，可建立“三明治”培養模型（sandwichcultured rat hepatocytes，SCRH）。傳統的原代肝細胞培養方式無法維持肝細胞的極性和代謝功能，而SCRH可同時擁有肝細胞形態和膽管的網絡狀結構，維持外排轉運蛋白的功能性表達，培養3個月均可檢測到白蛋白、纖維蛋白原、轉鐵蛋白和尿素的表達[20]。膽汁淤積性肝損傷在藥源性肝損傷中占有較高的比率（>30%），各種膽汁酸是膽汁淤積性肝損傷的主要損傷因素，可直接破壞細胞脂質膜，甚至誘發細胞凋亡，同時介導中性粒細胞浸潤，促進肝臟炎癥反應。因此闡明膽汁淤積的相關機制是中藥肝毒性研究的重要方向。SCRH已成為研究膽汁淤積和代謝酶誘導相互作用的主要工具之一。Zhuang等[21]研究發現Pgp抑制劑利托那韋顯著減少了大鼠SCRH模型中雷公藤甲素（TP）的膽汁清除率，同時Pgp誘導劑明顯增加了TP的膽汁清除率，提示膽小管膜表面表達的Pgp和TP可能會發生相互作用。Shen等[22]運用SCRH模型研究TP肝毒性的機制，結果顯示CYP3A4誘導劑可以減輕TP的肝毒性，而抑制劑會加劇TP的肝毒性，推測CYP3A4介導的TP的代謝途徑有可能是其解毒的機制。

143凝膠包埋肝細胞模型凝膠包埋肝細胞模型是一種三維擬組織化的體外肝細胞培養方式，可模擬藥物體內作用情況。單層貼壁培養的肝細胞很快喪失肝分化功能，不能較好地反映肝臟脂質代謝情況。凝膠包埋肝細胞模型可以較好的模擬體內細胞間微環境，保證代謝功能的長期維持，孟琴團隊[23]研究發現非諾貝特和平板培養肝細胞共孵育時，脂肪堆積和氧化壓力均不明顯，而凝膠培養肝細胞卻表現出與體內相符的毒性反應，ROS和MDA等氧化應激標志物上升，過量脂質和脂肪堆積。因此，凝膠包埋培養細胞比單層培養細胞對藥物的肝毒性更為敏感。該團隊還在此模型上驗證了利福平、四環素和硫唑嘌呤等20種藥物的肝毒性[2425]。

144微型中空纖維生物反應器由具有活性和功能的肝細胞以及可供細胞培養的生物反應器構成，將肝細胞置于生物反應器內，藥物通過半透膜與肝細胞進行生化作用[26]。沈沖等[27]證實該模型比單層培養肝細胞對對乙酰氨基酚毒性更敏感，這可能是因為中空纖維凝膠反應器具有較高的肝藥酶活性。此外，在中空纖維反應器中，甘草和甘草酸也體現了一定的保肝作用。

15肝損傷潛在血清生物標志物

新的肝損傷生物標志物，如精氨酸酶、血清F蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、蘋果酸脫氫酶等[28]雖然受到了廣泛關注，然而它們與ALT，AST一樣，都是容易失去活性的蛋白質，而且敏感性和特異性有待進一步考證，從而限制了其臨床應用。近年來，血清微小RNA（miRNA）為毒性的診斷開辟了一條新途徑。有學者對19種具有潛在肝臟毒性的中草藥進行臨床前安全性評價，在觀測體重、攝食量、血清生化指標、臟器系數與肝臟組織病理學改變的同時，探討miRNA作為新型候選標志物在中草藥肝損傷診斷中的應用價值。結果表明：與溶劑對照組相比，血清miRNA122水平顯著升高的給藥組有6組，而ALT和AST水平顯著升高的分別為2組和3組，其中五倍子組表現為急性藥源性肝損傷。在血清miRNA122的時間相關性和劑量相關性分析中，與血清ALT和AST相比，血清miRNA122呈現出更高的敏感性，表現為更早期和更大幅度的顯著升高。說明血清miRNA122作為中草藥肝損傷的新型候選診斷標志物，為中草藥臨床前安全性評價提供了新的參考依據。肖小河團隊通過SIMCAP11軟件進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），發現轉氨酶等傳統肝功能指標對生何首烏肝損傷作用不敏感，而血清直接膽紅素，膽紅素含量可在早期反映出何首烏引起的肝損傷[29]。毒理基因組學的快速發展也為肝毒性生物標志物的研究提供了新的技術手段。

16模式動物斑馬魚模型

斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因的相似度達87%，其信號傳導通路與人類基本近似。斑馬魚胚胎透明，利于直接觀察臟器的形態。斑馬魚最大限度地保留哺乳動物代謝的系統性，能體現Ⅰ相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結果，同時肝臟中有許多與哺乳動物同源的脂質代謝酶，包括HMGCoA合成酶、HMGCoA裂解酶和PPAR [30]。目前斑馬魚已被美國國家衛生研究院（NIH）列為繼人和小鼠之后的第三大模式生物。2012年，輝瑞、默克和強生聯合發表了一篇綜述文章，肯定了斑馬魚模型在早期肝毒性篩選中的作用[31]。斑馬魚模型篩查肝毒性具有以下特色與優勢：①靈敏度高，藥物質量濃度單位μg·L-1至mg·L-1，尤其適用于中藥微量成分肝毒性的評估；②高通量，實驗在微孔板進行，適合批量篩選；③簡單、高效，周期約為7～9 d[32]。正常斑馬魚肝組織清晰，He等[33]用解剖顯微鏡觀察用四環素、丙戊酸、紅霉素等肝毒性藥物處理后的斑馬魚發現，肝組織明顯變灰暗，并伴隨卵黃囊腫大。張云等[34]建立了肝臟標記熒光的轉基因（LFABP：EGFP）斑馬魚幼魚，通過熒光顯微鏡觀察對乙酰氨基酚的肝毒性。幼魚成活率呈時間和劑量依賴性，對乙酰氨基酚組的幼魚肝組織熒光強度明顯弱于對照組，肝臟形態異常，肝臟顏色變暗，卵黃囊腫大。以上結果證明了斑馬魚模型用于肝毒性快速評價的實用性。斑馬魚取血通常采用背主動脈橫切法（lateral incision），取血量少，對魚體積要求高，給實驗操作帶來諸多不便。國外學者Vliegenthart[35]首次嘗試后眼窩取血法，取血量翻倍，并且成功應用于斑馬魚血清miR122的檢測。

2具有中醫藥特點的肝毒性評價體系的初步構建

安全是有效的前提，中藥毒性評價及合理制用方法對學科和產業發展的重要性不言而喻。然后，當前中藥肝毒性評價的認識理念和技術方法還不夠完備，尚未形成一套符合中醫藥特點的、兼容并蓄的現代中藥肝毒性評價及合理制用方法體系，已成為制約中藥臨床療效發揮、安全用藥的關鍵瓶頸問題。

21系統生物學和網絡毒理學在中藥安全性評價領域的應用

過去中藥毒性評價主要運用病理學、生物化學、免疫學等技術對毒性靶點進行研究，其研究結果之間關聯性薄弱，難以凝練出毒性的核心靶點。2007年英國學者Hopkins首次提出了網絡藥理學，以網絡為基礎，繪制藥物靶點疾病三者之間的關系圖。而基于組學技術的系統生物學的深入研究也加速了網絡藥理學的發展。范驍輝等[36]把系統生物學和網絡藥理學有機結合，提出了“網絡毒理學”的概念，即通過整合網絡搜索算法和毒性預測方法等相關軟件，把已有的中藥物質基礎研究數據和毒理相關數據有機結合，建立可靠的毒理基因組學、毒理蛋白質組學等網絡庫，從而為藥物毒性評價提供理論依據和技術支持。網絡毒理學具有整體觀的優勢，它的出現無疑為中藥這一復雜體系毒性的研究提供了一種可行的思路。把這種研究模式與體外毒性篩選系統相結合，將能夠更全面、精確地預測和篩選有毒中藥的毒性。 211基因組學基因芯片，又稱為DNA微陣列，是由大量DNA或寡聚核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，可用于高通量監測肝毒性基因轉錄表達譜的變化。Luckert等[37]應用高密度基因表達譜芯片技術初步探討了4種吡咯里西啶生物堿（藍薊定、天芥菜堿、千里光寧、千里光堿）的肝毒機制，結果提示吡咯里西啶生物堿可能通過改變脂質代謝與膽汁酸流動，以及抑制FXR，LXR，SREBF1/2和PPARα/γ/δ等轉錄因子而產生肝毒性。Panigrahi等[38]在研究決明子Cassia occidentalis種子時利用基因微陣列對比分析大鼠肝臟基因的表達譜，研究表明當大鼠飼料中添加05%～20%的決明子種子時，與氧化應激、異生物質代謝、凋亡等相關的基因表達失調，推測決明子種子的肝毒性可能和Ⅰ相代謝酶（甲氧基異酚惡唑O脫乙基酶）和Ⅱ相代謝酶（谷胱甘肽S轉移酶）被抑制有關。

212蛋白質組學毒理蛋白質組學在中藥肝毒性方面的應用主要是通過比較肝臟在藥物作用前后的蛋白質表達譜的變化，在離體水平上更快、更準地篩選出毒性物質，并用于標志物和毒靶研究。Wei等[39]運用定量蛋白組學的方法尋找大鼠口服梔子苷后肝臟中的差異表達蛋白，進行圖像灰度分析，候選出5個生物標志物，其中2個標志物甘胺酸甲基轉移酵素和磷酸化酶比傳統的標志物更早的預測出梔子苷的肝毒性。

213代謝組學肝毒性藥物通過破壞細胞結構和功能導致內源性物質的穩態被破壞，代謝組學技術通過監測內源性代謝物的動態譜，可快速篩選出表征肝毒性的生物標志物，尤其適用于多通路多靶點的中藥肝毒性復雜體系的研究。有學者從疑似何首烏肝中毒的患者血清中篩選出4個與肝損傷相關的標志物。何首烏灌胃第4周ALT和AST才有顯著性改變；而上述代謝標志物在給藥1周后不同組別間即有顯著差異，可為臨床早期診斷何首烏肝損害提供參考[40]。

214網絡毒理學中藥肝毒性的發生很可能是多靶點、多途徑的，這種復雜毒性機制正好和網絡毒理學的優勢相契合。可從數據庫中抽提出中藥毒性靶器官的信息，借助可視化工具（Pajek，Cytoscape等）構建有毒中藥靶點網絡。比如，由范驍輝研究團隊開發的基于全基因組學的轉錄組學數據庫LTMap（http：//tcmzjueducn/ltmap），主要用于肝毒性的預測，已收錄20 123例基因芯片的生物學信息[41]。此外還有LiverTox，TGGATEs，CTD，TOXNET等肝毒性相關數據庫 [4243]。

雖然現階段已涌現出豐富的毒性數據庫，但筆者認為，在運用西方醫學數據庫構建中藥毒性網絡的同時應充分結合中醫證候的特點；在中醫理論的指導下，更好地開展中藥肝毒性的研究。

22以病/證模型為基礎詮釋中藥肝毒性

中藥毒性的有無、大小均與機體的狀態（即病/證）有關，即所謂的“有病就病受，無病則體受”。而根據中醫“有故無殞”藥物毒性理論，有毒中藥只要使用對證，其毒性自然降低。熟大黃對健康大鼠具有一定的肝毒性作用，ALT，AST呈劑量依賴的增高趨勢，肝臟病理切片顯示大鼠出現纖維化改變，但對于四氯化碳誘導的肝損傷具有顯著的護肝作用，在一定程度上驗證了“有故無殞”之說和辨證用藥減毒的科學性[44]。與正常動物比較，附子對寒證小鼠的LD50明顯升高；附子對類風濕關節炎（RA）大鼠及RA+寒證大鼠心臟毒性的TD50明顯升高；附子對RA+寒證大鼠（藥證相符）的心臟毒性明顯低于RA+熱證大鼠（藥證不符）。在病/證狀態下，附子的毒性呈降低趨勢，藥效呈上升趨勢，提示證候毒性藥效之間存在一定的相關性[45]。但目前絕大多數有毒中藥的安全劑量、毒性靶器官、中毒劑量等毒性信息源于生理狀態的正常動物，并未涉及病理狀態（包括病、證）對其毒性的影響，與臨床實際應用有明顯差異。因此，以疾病為基礎、結合中醫證候分類理論，能夠使中藥肝毒性評價更具針對性，也符合中醫診療的實踐過程與理論特色，為闡明量毒效關系和作用機制提供科學依據。

23“組分結構理論”為中藥量效毒關系的研究提供了一種新的思路

中藥重視“君臣佐使，七情和合”的組合形式，在辨證論治的基礎上，整體把握病因以及疾病的發展變化規律，利用多味中藥協調配合實現扶正祛邪的目的，從而使紊亂的機體系統調節至平衡狀態。古人曾有“中醫不傳之秘在于量”之說，這種“量”的特征恰恰就是臨床治療窗安全范圍的關鍵所在。某種成分可能在過量的情況下激活其他環節導致毒性，也可能在微量的情況下激活靶點的協同基因而增強藥效。

有學者提出劑量是調控毒效關系的最重要因素，尋找療效最大、毒性最小的最佳劑量是確定臨床安全窗的重點。但是筆者認為中藥是一個復雜體系，僅從劑量的角度不足以詮釋中藥“量”的獨特內涵。藥味的比例不同、單味藥物質基礎組成結構的差異，都可能產生無效或毒性的顯著差別。中藥物質基礎“組分結構理論”中描述到中藥是多成分構成的，這些成分并不是簡單地堆積，活性成分按照理化及藥理性質分為不同組分，可以有生物堿、皂苷、黃酮組分等，在生物堿組分內又分為苦參堿、吳茱萸堿等，單體成分作為基本功能單位；這些成分在組分內以及組分間都有一定的組成和量比關系，即結構特征，通過多靶點、多層次、多途徑的整合產生藥效。對于毒性，也存在同樣的調控方式，只是這種調控超出了原有的平衡范圍。不同的物質基礎組成在產生藥效作用的同時，也同樣產生了毒性作用。例如，關于澤瀉的腎毒性，一直存在不小的爭議，同品種但不同產地的澤瀉存在毒性差異[4648]，可能是成分的量比關系導致了毒性的差異。有學者開展了柴胡水/醇提物的毒性實驗，發現其毒性較低（表現為ALT和AST的升高），但肝臟未見明顯的病理變化。對上市中藥小柴胡顆粒進行毒性再評價，同樣沒有觀察到明顯的肝毒性。但其主要成分柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2均可抑制肝細胞生長，作用強度為d>a>b2。在胃酸的作用下柴胡皂苷d易轉化為b2，而柴胡皂苷b2的毒性明顯低于d [49]。雖然柴胡的安全劑量遠大于臨床常用量，但其潛在的肝毒性不容忽視。加強柴胡藥材的質控，明確皂苷組分量效毒的關系對于臨床安全用藥尤為重要。因此，“組分結構理論”為解釋中藥毒性差異提供了理論依據，也為進一步揭示毒性機制提供了切實可行的思路和方法。

24結合網絡毒理學和病/證模型的中藥量效毒研究思路的探討

機體是一個復雜的生物網絡，中醫“證候”可能是蛋白質網絡和基因調節網絡被“擾動”后所發生的一種特異性變化狀態。而中藥的有效性或毒性與其對生物網絡中心節點的干預有關。基于“組分結構”理論，中藥的物質基礎是一個多維多層次的網狀結構，在組分間以及組分內都有相對確定的組成和量比關系。不同的組分/成分驅動體內相互關聯的若干靶點群，當所產生的靶點效應被過度放大或調節失衡就有可能導致毒性效應。這種毒性效應，表現在靶器官靶組織靶分子損害的多個層次，呈現復雜的網絡特征。網絡毒理學是從“點（生物靶分子）線（途徑）面（網絡）”多個水平說明中藥毒性事件鏈構成及其因果關系，避免以往單純的化學藥品或者簡單的天然藥物“一對一”的理論模式的不足，即一種藥物引起一種毒效應或一種靶分子改變。結合了病/證模型的網絡毒理學則是在中藥干預對證機體過程中收集生物學信息，同時結合毒性相關數據庫，整合信息之間的相互關系，以此構建與證候標志物、毒性標志物關聯的中藥成分毒性靶點網絡。所構建的網絡，通過網絡映射、拓撲結構分析、網絡聚類等方法從宏觀層次分析中藥毒性產生的機制。

研究人員逐漸認識到網絡毒理學和病/癥模型在中藥毒性研究中的重要性，嘗試著將兩者結合運用到肝毒性的考察中。譚勇等[50]采用“氫化可的松造模法”建立腎陽虛證大鼠模型考察白附片對正常和腎陽虛大鼠的肝毒性差異。中醫認為制附子入腎經、具有補火助陽的功效，這就可以解釋同等劑量下白附片對正常大鼠的肝毒性更突出，在腎陽虛大鼠中肝毒性顯著緩和。代謝組學的研究進一步發現，氧化磷酸化、氨基酸和脂質代謝異常是白附片干預2種狀態大鼠代謝輪廓的差別所在。

基于上述的毒性評價技術和體系，本課題組也初步探索了臨床常用中藥淫羊藿的肝毒性機制。近年來，傳統認為無毒的補益類中藥淫羊藿的毒副作用屢見報端。文獻報道淫羊藿總黃酮沒有明顯的長期毒性[51]，最大耐受量實驗顯示小鼠口服淫羊藿總黃酮最大耐受量相當于人臨床日用量的1 440倍，提示淫羊藿總黃酮急性毒性很小[52]。但也有極個別文獻提及到淫羊藿的肝毒性，如，給藥3 d小鼠即出現嘔吐、納差、活動減少，給藥15 d處死，可見肝臟脂肪變性，該作者同時推測淫羊藿的雄激素樣作用和肝毒性密切相關[53]。此外，中國中醫科學院西苑醫院王停教授提出“基于基原用藥部位工藝劑量療程結合數學方法對淫羊藿肝毒性的研究”，該項目獲得了2013年國家自然科學基金的資助（81374056）。臨床上報道有肝毒性的中藥復方中，仙牛健骨顆粒、壯骨關節丸、仙靈骨葆膠囊中均含有淫羊藿。本實驗室基于斑馬魚模型也證實淫羊藿總黃酮高劑量組有一定的毒性。以上種種跡象提示淫羊藿可能是肝毒性的誘因。《本草綱目》中記載：淫羊藿，性溫不寒，能益精氣，真陽不足者宜之，陰虛而相火易動者忌服。中醫強調辨證論治，以中醫證候分類理論為基礎，能夠使淫羊藿肝毒性評價更具針對性。課題組既往采用代謝組學技術，運用正交偏最小二乘判別分析法研究了淫羊藿生品與炮制品對腎陽虛大鼠血漿代謝譜的影響。結果表明淫羊藿生品和炮制品干預后大鼠血漿代謝譜的軌跡均向正常組趨近，與淫羊藿生品組相比，炙淫羊藿能更好地調節腎陽虛大鼠體內的脂質代謝紊亂并使其回歸至正常，初步揭示了炙淫羊藿補腎壯陽的增效機制[54]。不同病/證狀態下藥物的ADME差異性決定了有毒中藥毒性的差異性，鑒于此，課題組對比了淫羊藿總黃酮在正常大鼠和骨質疏松模型大鼠中的代謝差異，淫羊藿總黃酮在骨質疏松大鼠的腸道菌群和十二指腸酶中的水解速率明顯慢于正常大鼠，預示著其吸收和代謝進程也變緩慢，為后續的毒性研究和臨床應用提供參考數據和設計依據。

3結語

近年來，現代科技迅速發展，各種質譜聯用技術及核磁技術的應用使得國內外對中藥肝毒性的機制研究不斷深入，已逐漸由整體動物模型研究向細胞、分子水平延伸，并基于網絡藥理學構建了毒性中藥數據庫，取得了一定的研究進展。在藥物研發的早期階段，肝細胞、亞細胞和三明治培養等體外模型、模式動物斑馬魚等新的研究方法在肝毒性的高通量篩選中發揮著舉足輕重的作用。盡管體外模型不能完全等同于體內模型，但是其高效的優勢是體內模型不具備的。同時，它可以減少動物的使用量和實驗經費，縮短實驗周期，為從事藥物開發的研究者提供科學的依據。而系統生物學因其特有的整體觀優勢，在中藥肝毒性研究領域也有著廣闊的應用前景，可用于肝毒性物質基礎的辨析、毒性規律的探究，并為毒性標志物的篩選、毒性預測以及毒性數據庫的建立奠定了基石。因此，建立恰當的證候對應的整體動物模型，從量效毒關系研究入手，采用代謝組學、網絡生物學與網絡藥理學理論和技術詮釋有毒中藥對證控毒的科學內涵，將有可能探索出中藥控毒研究的新思路與新方法。雖然網絡毒理學的發展為中醫藥肝毒性的系統研究開辟了嶄新的途徑，但目前存在的問題也是不容忽視的。比如網絡毒理學需要系統、真實、科學的數據庫作為支撐，以及不斷的動物試驗和臨床試驗等來驗證和豐富。

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