菠蘿葉提取物黏附漂浮微丸的制備及評價

何亞麗+黎迎+楊丹丹+朱春燕

[摘要]采用擠出滾圓法，以殼聚糖為骨架黏附材料，十八醇為漂浮材料，制備菠蘿葉提取物（Bolo leaf phenols，BLP）黏附漂浮微丸，評價其體外黏附性、漂浮性及體內滯留情況，并考察藥物的體外釋放特性。通過體外組織留存量法和直接觀察法分別評價微丸的體外黏附性和漂浮性；采用體內組織留存量法和小動物活體成像法考察微丸在大鼠體內的滯留情況；對微丸中指標成分對香豆酸和咖啡酸的體外釋放情況進行評價。結果顯示，制備的黏附漂浮微丸體外黏附性達（732±34）%，在人工胃液中可立即起漂，持續漂浮時間在12 h以上；黏附漂浮微丸在大鼠胃內6 h時滯留率達40%以上，而普通參比微丸胃滯留率低于15%，兩者相比，滯留效果具有顯著性差異（P<001）；藥物體外釋放時間可達6 h以上，體外釋藥機制符合Higuchi方程。體內、外研究表明，制備的BLP黏附漂浮微丸具有良好的胃滯留效果和緩釋特性。

[關鍵詞]BLP黏附漂浮微丸； 組織留存量； 小動物活體成像； 體外釋放； 緩釋

菠蘿葉提取物（Bolo leaf phenols，BLP），含有30%～80%的總酚性成分，其中對香豆酸（pCA）和咖啡酸（CA）為主要指標成分[15]。BLP具有明確的抗氧化和調血脂作用[67]，其主要成分對香豆酸體內半衰期t1/2β為0587 h[8]，且對小鼠無明顯生殖毒性[9]。基于BLP的藥理活性，具有開發為臨床藥物的良好前景。

課題組前期對BLP的理化性質和吸收部位的研究表明，BLP在胃和小腸腸段的生理pH下穩定，在胃腸道吸收窗較長，且在酸性條件下脂溶性好，吸收較好[1011]。本研究應用胃滯留給藥系統，采用擠出滾圓法制備殼聚糖黏附漂浮微丸，通過對微丸體外黏附性、漂浮性和體內滯留情況的考察，評價微丸的胃內滯留效果；通過微丸體外釋藥情況，考察微丸的體外釋藥機制。本研究旨在延長藥物在胃部的滯留時間，促進藥物的吸收，改善生物利用度。

1材料

11藥物與試劑

BLP（清華大學杜立軍教授實驗室提供，批號110801）；BLP黏附漂浮微丸（自制，批號20160312）；對香豆酸對照品（pCA，美國Sigma公司，批號1001108036）；咖啡酸對照品（CA，美國Sigma公司，批號2063612）；殼聚糖（CTS，美國Sigma公司，CAS9012764）；微晶纖維PH101（MCC，日本旭日化成公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC K4M，美國卡樂康）；十八醇（北京化學試劑公司）；甲醇、乙腈（美國Fisher公司，色譜級）；DIR熒光染料（美國Invitrogen公司）；其余試劑、試藥均為分析純。

12儀器

島津高效液相色譜儀（LC10AT泵，SPD10AVP紫外檢測器）；CTO10ASV柱溫箱；小動物活體成像儀（美國IVIS Spectrum）；擠出滾圓機（英國Caleva公司）；盤式干燥烘箱（英國Caleva公司）；電熱恒溫水浴鍋（HHSY11Ni2B，北京長風儀器儀表公司）；攪拌機（北京中興柏翠電器有限公司）；Sartorius BSA 224SCW型天平。

13動物

SD大鼠，雄性，體重（220±20） g，北京市維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SDXK （京） 20150001。

2方法與結果

21微丸的制備

按處方稱取主藥和輔料，過80目篩，加黏合劑不斷捏合，制成軟材。經擠出機篩板（孔徑 07 mm） 以35 r·min-1的轉速擠成直徑相同、光滑致密的條狀物； 將條狀物置于滾圓機（孔徑 07 mm） 內，以1 300 r·min-1的速度滾圓10 min，直至滾制成丸；取出微丸，50 ℃干燥4 h，過40目篩，制得所需微丸。

22體外黏附性考察

取新鮮離體大鼠胃，用01 mol·L-1鹽酸將胃內壁沖洗干凈，固定在玻璃片上，精密稱取微丸約500 mg，均勻置于胃組織上。在相對濕度為925%的恒濕密閉容器中放置20 min充分水化后，將玻片傾斜45°放置，調節蠕動泵流速為20 mL·min-1，用01 mol·L-1鹽酸100 mL沖洗。沖洗液收集于已知質量的燒杯中，70 ℃烘干，稱重[1114]。微丸體外黏附百分率=M-（G-g-m）/M×100%。式中M為加入微丸的量；g為空燒杯重；G為燒杯與烘干后殘渣總重；m為同體積沖洗液所含固體物質的量（空白對照）。實驗結果得出，制備的黏附漂浮微丸體外黏附性達（732±34）%，體外生物黏附性良好。

23體外漂浮性考察

稱取微丸約300 mg，置于100 mL，（370±05） ℃的01 mol·L-1 HCl溶液中，直接觀察微丸的起漂和持續漂浮時間[1517]。結果表明，制備的黏附漂浮微丸，在人工胃液中可立即起漂，持漂時間在12 h以上，具有良好的體外漂浮性。

24體內滯留性考察

241體內組織留存量法取健康SD大鼠，禁食不禁水24 h，隨機分2組，一組胃插管灌服黏附漂浮微丸，另一組灌服普通參比微丸，給藥量400 mg·kg-1。于給藥后1，2，4，6，8，10，12 h時間點處死大鼠，取出大鼠胃部，沿胃大彎方向從賁門到幽門處剪開直接觀察胃內有無微丸滯留，并拍攝觀察到的微丸胃內滯留現狀，見圖1。通過觀察得出，制備的黏附漂浮微丸在6 h時仍有大量滯留于胃內，而普通參比微丸在4 h時已大量從胃內排空；表明制備的黏附漂浮微丸具有胃滯留的效果。

用01 mol·L-1鹽酸100 mL沖洗并收集胃內滯留微丸，用烘箱70 ℃烘干，稱重記錄各時間點胃

254藥物釋放模型的擬合分別用零級，一級，Higuchi和RitgerPeppas方程對BLP黏附漂浮微丸中指標成分對香豆酸和咖啡酸的體外釋藥曲線進行擬合，見表1，2。結果顯示，BLP黏附漂浮微丸中對香豆酸和咖啡酸的釋放曲線經Higuchi方程擬合相關性最好，表明藥物的釋藥機制以Fick′s骨架型擴散為主，即藥物首先溶解通過殼聚糖骨架材料擴散到骨架外表面，再擴散到釋放介質中，起到緩釋的效果。

3討論

課題組前期對BLP理化性質和吸收部位的考察表明，其在胃腸道吸收窗較長，酸性條件下穩定且吸收良好，但由于人體在正常情況下胃排空的時間僅為 15～2 h[21]，因此藥物的胃滯留時間非常短，所以本研究設計應用胃滯留給藥系統，使藥物較長時間滯留于胃液中，延長藥物釋放時間，改善藥物吸收，從而提高藥物生物利用度。有文獻報道指出，在胃酸條件下有較好溶出或胃腸上端吸收良好的藥物，尤為適用于胃黏附漂浮協同型胃滯留給藥系統[22]，因此本研究設計將藥物制成胃黏附漂浮型微丸。從劑型角度，微丸這種多單元劑型，其在胃內分布均勻一致，不僅避免了胃排空中的“全無”或“全有”造成的個體差異性，而且與片劑、膠囊劑等單元劑型相比避免單元系統控制不好時引起藥物的突釋或釋放不完全[23]。

研究表明[2425]，殼聚糖具有促進藥物吸收的作用。基于殼聚糖良好的生物黏附性和黏膜吸收促進性及在酸性條件下易溶解的性質，并結合課題組前期對藥物BLP性質的研究，在處方考察中主要應用殼聚糖為骨架材料制備微丸。對制備的微丸從體外

黏附性、漂浮性、體內滯留效果、體外釋放等方面進行了評價，得出制備的微丸達到了預期的胃滯留的效果。本研究應用生理解剖學方法考察胃內微丸留存量；并采用先進的小動物活體成像技術，通過觀察活體動物體內熒光分布，快速、有效評價微丸胃內滯留效果，建立了微丸體內胃滯留效果的評價方法。

應用生理解剖學方法，對大鼠胃內給藥微丸的滯留量進行定量分析得出，黏附漂浮微丸在6 h時仍有40%以上的滯留，而普通參比微丸6 h時滯留量不足15%，兩者相比，胃滯留效果具有顯著性差異（P<001）。應用小動物活體成像技術對活體大鼠胃內微丸滯留效果進行評價發現，制備的黏附漂浮微丸在胃內6 h時仍有熒光分布，而普通參比微丸胃部已無熒光分布，對比差異明顯，與體內胃組織微丸留存量考察結果具有一致性，證明制備的BLP黏附漂浮微丸具有胃滯留的效果，在胃內滯留時間可達6 h以上。

BLP黏附漂浮微丸中對香豆酸和咖啡酸的釋放曲線經Higuchi方程擬合相關性最好，表明BLP黏附漂浮微丸中藥物的釋藥機制以Fick′s骨架型擴散為主，即藥物首先溶解通過殼聚糖骨架材料擴散到骨架外表面，再擴散到釋放介質中，起到緩釋的效果，體外釋放時間可達6 h以上。通過小動物活體成像評價的微丸體內滯留時間達6 h以上，結果表明微丸的滯留效果與體外釋放時間具有一致性。因此將藥物制成黏附漂浮微丸，延長藥物在胃腸道的滯留時間。可以改善藥物的吸收。

胃滯留制劑作為一代新型的緩、控釋制劑，近年國內外學者對新型胃滯留給藥系統的研究正不斷地深人和加強，但目前對胃滯留給藥系統的體內動力學過程、體內滯留評價等方面研究尚不夠深人，缺乏適宜的體內外評價手段和方法。本研究結合胃黏附制劑和胃漂浮制劑的特點成功制備了具有胃腸道滯留效果的BLP黏附漂浮微丸，是對該藥物在中藥制劑領域的嘗試。本研究探索性的應用生理解剖學結合當前先進的小動物活體成像技術，建立了較完善的微丸體內胃滯留評價方法，并對制備的BLP黏附漂浮微丸體內胃滯留效果做出了評價。結果表明，本研究所制備的BLP黏附漂浮微丸在胃內可滯留6 h以上，具有良好的胃滯留效果。在體外的釋放研究中，微丸的釋藥特性表明具有制備的微丸具有緩釋效果。由以上研究，預測本實驗制備的BLP黏附漂浮微丸可以長時間滯留于胃腸道而維持藥物的持續釋放，從而促進BLP的吸收，提高BLP的生物利用度。由于對藥物在體內的具體吸收情況尚不能明確，因此本研究將進一步進行體內藥動學實驗，探究自制的BLP黏附漂浮微丸的體內吸收情況，并以原料藥為參比，對比藥物體內生物利用度差異，考察制備的BLP黏附漂浮微丸是否達到了研究的預期效果。

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