櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導技術初探

劉義存　黃天啟

摘 要：通過對外界環境如溫度、光照等條件對愈傷組織誘導的影響研究。結果：葉片培養在溫度22℃時愈傷組織誘導的效果最好，可達到81.82%；有經過10 d黑暗培養處理的葉片，愈傷誘導率整體有明顯提高；在最適溫度和黑暗培養處理下，培養基配方為MS+BA 0.2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，櫟葉枇杷葉片的愈傷誘導率達到100%。

關鍵詞：櫟葉枇杷；葉片；愈傷組織；誘導

中圖分類號：S667.3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131005

枇杷屬植物（EriobotryaLindl.），屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），分布于我國南部或東南亞地區的亞熱帶常綠樹種，全世界枇杷屬植物約有 30 個種或變種[1]，其中大部分都處于野生狀態。野生枇杷蘊含豐富的遺傳多樣性，還具有一些可以用于栽培枇杷遺傳改良的重要性狀，如抗病蟲、抗逆、抗倒伏等。野生枇杷與栽培枇杷不存在生殖隔離，容易通過常規育種或者生物技術手段將這些優良性狀漸滲到栽培枇杷中去，使栽培枇杷不僅可獲得優良性狀，同時也拓寬遺傳背景[2，3]。此外，野生枇杷還是優良砧木資源。關于枇杷胚、莖尖、胚乳、原生質體的離體培養均有不少研究，但關于葉片愈傷組織的研究，在栽培枇杷上尚有若干報道[4-7]，在野生枇杷上則鮮有報道。本文對櫟葉枇杷的葉片誘導愈傷做了研究，旨在尋找最佳愈傷組織誘導的培養基配方以及培養條件，為下一步誘導胚、離體保存乃至形成新的植株提供一定的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料選取

以櫟葉枇杷（E.prinoidesRehd.andWils）組培苗的葉片為實驗材料。

1.2 處理方法

取組培苗中成熟新鮮的葉片，在超菌工作臺中切成大小約為0.5cm×0.5cm的小塊，并迅速接種到相應的培養基中。接種時，葉片背向下，與培養基充分接觸。整個過程控制在10～15 min一組。所有處理暗培養10d后，再轉為全光照培養。

1.3 統計方式

本試驗每個處理接種20塊葉片，每處理重復2次；設置不同的實驗組合，具體實驗方案見文中的結果與分析。統計時間為接種后第30天；實驗結果采用SAS11.0處理，部分數據采用Duncans新復極差法。

1.4 培養基配方

培養基主要成分：基本培養基為MS基本培養基，附加3%蔗糖、5g·L-1 的瓊脂粉。

1.5 培養條件

培養濕度條件為：65%～70%；24 h全光照或全黑暗處理。

2 結果與分析

2.1 溫度對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導的影響

為了探究櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導的最適溫度，我們以櫟葉枇杷的葉片為材料，培養基配方為MS+KT 0.2+BA 0.2+NAA 0.5。設置3個不同溫度，每個處理重復2次，每個重復接種20個材料。接種后，全黑暗處理10 d后，統計結果如表1。

在不同的溫度處理下，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導率有一定的差別。當處理溫度為18℃和25℃時，葉片的愈傷組織誘導率都約為50%，沒有什么差別；當處理溫度為22℃時，葉片的愈傷組織誘導率達到81.82%。說明溫度偏高或偏低都不利于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導，只有22℃時，比較適合葉片愈傷組織的形成。

2.2 黑暗培養對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導的影響

為研究經全黑暗培養和沒有經黑暗培養的處理條件下對櫟葉枇杷愈傷組織誘導的影響。設置2組實驗，第1組為材料接種到培養基后，便在每天24h光照下培養30d；第2組為材料接種到培養基后，便每天24h全黑暗下培養10d，再轉為每天全光照24h下，再連續培養20d。以上兩組實驗都設置如表2的6個不同的配方組合處理。培養溫度為：22℃。結果如圖2所示。

由圖1可以看出，除了配方3沒有誘導出愈傷組織外，其他培養基配方均誘導出葉片愈傷組織；有經黑暗培養10 d的第1實驗組，除了配方3，其它配方的愈傷誘導率明顯都高于另外一組沒經黑暗階段的第2組實驗，在有經過黑暗處理的配方上，平均愈傷組織誘導率為57.8%，而實驗組2的平均愈傷誘導率為40%；尤其黑暗處下的MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1配方，誘導率可以達到100%，啟動也相對較快。與此同時，在配方MS+BA 1.0這一組處理中，原本在全光照下無法誘導愈傷組織生長的配方，而經黑暗處理后誘導出了愈傷組織，并取得了40%的誘導率。說明黑暗處理對于枇杷愈傷組織的誘導起到了很大的促進作用。

實驗還發現，在黑暗培養實驗組下的葉片，大部分的處理在接種4d后開始膨大，10d后從葉片邊緣和葉脈處出現愈傷組織，30d 時已長出大量愈傷組織；而沒有經黑暗培養實驗組在同樣的時間點確實沒有特別明顯的愈傷組織出現。

2.3 不同植物生長調節劑對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導的影響

由圖1可得，如單獨使用 6-BA的愈傷組織誘導率為40%；單獨使用KT處理的誘導率為50%；而單獨使用2，4-D，不添加任何細胞分裂素，愈傷誘導率為只為0%。而在添加低濃度6-BA 0.2 mg·L-1和KT 0.2 mg·L-1的基礎上改變2，4-D的濃度，所有處理都要比較單獨使用一種植物生長調節劑的的愈傷誘導率要高。

在添加6-BA、KT與2，4-D不同濃度的組合中，發現隨著2，4-D濃度的升高，愈傷誘導率出現明顯的下降。當2，4-D濃度為1.0 mg·L-1時，愈傷誘導率為100%；當2，4-D濃度為3.0 mg·L-1時，愈傷誘導率降為96.67%；隨著2，4-D濃度升高到6.0 mg·L-1時，愈傷誘導率已經降為60%。可見，2，4-D 對于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導形成有重要的促進作用，但濃度不宜過高，也不適合單獨使用。實驗表明，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導最適合的培養基配方為MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1。

3 結論

環境的培養因素對櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導有較大影響。在本文的3個溫度設置試驗中，數據顯示在溫度22℃時，是比較適合葉片愈傷組織的誘導。另外，單一使用某一種生長調節物質所得的效果并不如多種配合使用，尤其是2，4-D，單獨使用幾乎沒有效果，但是配合BA，KT時則大大提高了櫟葉枇杷葉片愈傷誘導率。通過對野生枇杷櫟葉枇杷的葉片愈傷組織誘導實驗，認為在培養溫度22℃下，以MS+BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1作為最適培養基，材料接種后黑暗處理10 d，再轉為全光照，是櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導的最佳培養條件。通過本試驗，對野生櫟葉枇杷葉片愈傷組織有了一定的實驗基礎，從而為探索其它野生種枇杷屬植物的葉片愈傷組織誘導研究提供一些理論依據和實驗借鑒。

參考文獻

[1]林順權，楊向暉，劉成明，等. 中國枇杷屬植物的自然地理分布[J]. 園藝學報，2004，31（5）： 101-104.

[2]劉義存，岑偉儀，黃天啟， 等. 枇杷屬植物莖尖離體培養及褐化抑制研究[J]. 果樹學報， 2014（3）： 011.

[3]楊鳳玲，林順權. 枇杷葉片愈傷組織的誘導與保存[J]. 亞熱帶植物科學，2005（04）：1-5.

[4]陳紅. 枇杷花藥愈傷組織誘導的研究[D].四川農業大學，2003.

[5]彭曉軍，王永清. 枇杷胚乳愈傷組織誘導和不定芽發生的研究[J]. 四川農業大學學報，2002（03）：228-231.

[6]林慶良，林順權，陳振光. 櫟葉枇杷原生質體的分離與培養[J]. 福建農業大學學報，1994（01）：26-29.

[7]Wai-Jane Ho，高峰. 枇杷愈傷組織培養物經體細胞胚胎發生再生出植株[J]. 福建果樹，1989（01）：66-67.

作者簡介：劉義存（1979-），男，助理研究員，博士，主要研究方向：園藝植物種質資源與生物技術；黃天啟（1993-），男，在讀研究生，主要研究方向：果樹生物技術。