江西地區鮑曼不動桿菌NDM-1及其他碳青霉烯酶基因檢測研究

陳 嬌，吳秀珍，劉 康，胡雪飛，陳開森，張黎明，陳 賀

(1江西衛生職業學院，江西 南昌 330052； 2 南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006； 3 南昌大學第二附屬醫院，江西 南昌 330006)

·論著·

江西地區鮑曼不動桿菌NDM-1及其他碳青霉烯酶基因檢測研究

陳 嬌1，吳秀珍1，劉 康1，胡雪飛2，陳開森2，張黎明3，陳 賀3

(1江西衛生職業學院，江西 南昌 330052； 2 南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006； 3 南昌大學第二附屬醫院，江西 南昌 330006)

目的 了解江西地區耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)NDM-1及其他碳青霉烯酶基因攜帶情況，為預防和控制醫院感染提供實驗室依據。方法 收集2015年1月—2016年6月江西地區3所三級甲等醫院臨床標本分離的CRAB共64株，采用K-B法測定其對常用抗菌藥物的敏感性，采用改良Hodge試驗和EDTA協同試驗篩查CRAB產碳青霉烯酶和金屬酶的情況，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測碳青霉烯酶基因，對產NDM-1的鮑曼不動桿菌進行接合試驗。結果 CRAB 對氨芐西林/舒巴坦、環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率高達95.31%、98.44%、90.63%、54.69%。CRAB菌株改良Hodge試驗陽性率為76.56%，EDTA協同試驗陽性率為96.88%。PCR擴增結果顯示， 87.50%(56株)的CRAB攜帶OXA-23、VIM-1基因，18.75%(12株)攜帶SIM基因，3.13%(2株)攜帶OXA-24基因，26.56%(17株)攜帶NDM-1基因。攜帶NDM-1基因的CRAB均來自于南昌大學第一附屬醫院，其中64.70%(11/17)表現為泛耐藥。接合試驗結果顯示，攜帶NDM-1基因的菌株可將NDM-1基因傳遞給受體菌大腸埃希菌J53，使其獲得對亞胺培南的耐藥性。結論 該地區臨床分離的CRAB耐藥率高，碳青霉烯酶基因以OXA-23、VIM-1基因型為主，檢出NDM-1基因陽性CRAB，NDM-1基因可能存在醫院內的克隆傳播，應盡快采取有效措施預防和控制NDM-1基因陽性CRAB的傳播。

鮑曼不動桿菌；多重耐藥菌；碳青霉烯酶基因；醫院感染

[Chin J Infect Control，2017，16(2)：109-114]

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是臨床上常見的條件致病菌，廣泛存在于自然界、醫院環境及人體皮膚，可引起許多常見的醫院感染，如血流感染、肺部感染、傷口感染、導管相關感染、尿路感染和菌血癥等[1]。二十世紀七十年代鮑曼不動桿菌對大多數抗菌藥物仍較敏感，由于菌株本身具有快速獲得對多種抗菌藥物耐藥的能力，現已成為全球醫院感染的主要病原菌[2]。 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)是指對碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌。在我國，CRAB的廣泛流行給臨床醫生抗感染治療帶來嚴峻挑戰[3]。本研究收集了江西地區3所三級甲等醫院的CRAB并對其耐藥性、產金屬酶的表型及產Ⅰ型新德里金屬β-內酰胺酶 (New Delhi metallo-β lactamase 1，NDM-1)等碳青霉烯酶基因表型進行分析，從而為臨床抗感染治療，預防和控制醫院感染提供實驗室依據。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 收集2015年1月—2016年6月江西地區3所三級甲等醫院檢驗科臨床標本中分離的CRAB共64株，其中南昌大學第一附屬醫院55株，南昌大學第二附屬醫院5株和江西省人民醫院4株，排除同一患者不同部位分離的同種菌株，留取初次分離菌株。改良Hodge試驗的陰性對照和陽性對照菌株由溫州醫學院第一附屬醫院檢驗科張鐵麗教授贈予，ATCC 25922菌株和ATCC 27853菌株由江西省臨床檢驗中心吳茂紅主任技師贈予，J53菌株由鄭州大學肖偉強贈予。

1.2 細菌鑒定與藥敏試驗 采用K-B法檢測鮑曼不動桿菌對常見抗菌藥物的敏感性，同時采用瓊脂稀釋法檢測鮑曼不動桿菌對美羅培南的最低抑菌濃度(MIC),并利用VITEK 2全自動分析儀對細菌鑒定與藥敏結果進行分析，藥敏結果判讀標準依據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2014年版標準。 質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。由于鮑曼不動桿菌復合物包括鮑曼不動桿菌、不動桿菌基因種群3、醋酸鈣不動桿菌及13TU，此四類菌種生化特點相似，VITEK 2分析儀不能將其區分，而blaOXA-51基因為鮑曼不動桿菌天然攜帶的基因，因此我們利用PCR方法擴增菌株OXA-51基因，從而確定為鮑曼不動桿菌。

1.3 改良Hodge試驗 根據CLSI推薦的方法進行操作，將0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC 25922均勻涂布于M-H平板，亞胺培南紙片貼于平板中央，待測菌株自藥敏紙片邊緣向平板外沿劃線培養，37℃過夜培養后觀察結果，亞胺培南抑菌圈內出現大腸埃希菌矢狀生長者表明待測菌產碳青霉烯酶，分別設陰性和陽性對照。

1.4 EDTA協同試驗 0.5麥氏單位的待檢菌株涂布于M-H平板，貼兩張亞胺培南紙片(10 μg)，向其中一張亞胺培南紙片上滴加0.5 mol/L EDTA 10 μL，37℃過夜培養，若滴加EDTA的亞胺培南紙片與未滴加亞胺培南的紙片所產生的抑菌圈之差≥5 mm，則可判斷該待測菌為金屬酶陽性。

1.5 耐藥基因檢測 按照Omega公司細菌DNA提取試劑盒的操作步驟提取菌株DNA。運用聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測NDM-1等碳青霉烯酶基因，PCR引物和方法參考以下標注文獻進行，具體引物序列及產物長度見表1。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，PCR擴增所獲基因DNA送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，測序后經NCBI GenBank Blast比對驗證。

表1 鮑曼不動桿菌耐藥基因引物序列及產物長度

Table 1 Primer sequence and product length of drug-resistant genes ofA.baumannii

基因引物序列(5'-3')產物長度(bp)AmblerA組碳青霉烯酶基因 KPC-F[4]ATGTCACTGTATCGCCGTCT785 KPC-RTAGACGGCCAACACAATAGG SME-F[5]AACGGCTTCATTTTTGTTTAG1138 SME-RGCTTCCGCAATAGTTTTATCA GES-F[5]GTTTTGCAATGTGCTCAACG371 GES-RTGCCATAGCAATAGGCGTAGAmblerB組碳青霉烯酶基因 NDM-F[6]CGCAACACAGCCTGACTTTC287 NDM-RTCGTGATGAGCCATTCCGCC NDM-up168[6]GAATGTCTGGCAGCACACTT480 NDM-dw647TTGGCCTTGCTGTCCTTGAT SPM1-F[5]CCTACAATCTAACGGCGACC650 SPM1-RTCGCCGTGTCCAGGTATAAC GIM1-F[5]AGAACCTTGACCGAACGCAG748 GIM1-RACTCATGACTCCTCACGAGG SIM1-F[5]TACAAGGGATTCGGCATCG571 SIM1-RTAATGGCCTGTTCCCATGTG IMP1-F[7]CATGGTTTGGTGGTTCTTGT448 IMP1-RATAATTTGGCGGACTTTGGC VIM1-F[7]GATGGTGTTTGGTCGCATA390 VIM1-RCGAATGCGCAGCACCAG VIM2-F[7]ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG801 VIM2-RCTACTCAACGACTGAGCGAmblerD組碳青霉烯酶基因 OXA-23-F[7]GATGTGTCATAGTATTCGTCG1048 OXA-23-RTCACAACAACTAAAAGCACTG OXA-24-F[7]GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA249 OXA-24-RAGTTGAGCGAAAAGGGGATT OXA-51-F[6]TAATGCTTTGATCGGCCTTG351 OXA-51-RTGGATTGCACTTCATCTTGG OXA-58-F[7]AAGTATTGGGGCTTGTGCTG599 OXA-58-RCCCCTCTGCGCTCTACATAC

1.6 接合試驗 供體菌(攜帶NDM-1基因的鮑曼不動桿菌)和受體菌(疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53)分別接種于2 mL LB肉湯中37℃振蕩培養(220 r/min)6 h，分別將供體菌和受體菌濁度調整至2個麥氏單位，按照1∶1比例混勻兩種細菌，將混合菌接種至1 mL LB肉湯培養基中，37℃過夜培養。取20 μL混合菌液接種至M-H瓊脂平板(含亞胺培南2 μg/mL+疊氮鈉100 μg/mL)，同時取原始供體菌及受體菌各20 μL接種于同一雙抗平板上作對照，37℃過夜培養。只有當對照菌在雙抗平板上不生長而接合菌生長時,方能判斷生長出來的接合子有意義，此時進一步對接合子進行生化鑒定，確定接合子為大腸埃希菌，再運用PCR方法確定接合子NDM-1基因陽性，即可判定接合成功，最后對接合成功的NDM-1質粒接合子使用K-B法進行藥敏試驗。

2 結果

2.1 菌株臨床分布及耐藥性 64株CRAB主要來自神經內科重癥監護病房(NICU，15株，23.44 %)，重癥監護病房(ICU，12株，18.75%)，神經外科(9株， 14.06%)和其他科室(28株，43.75%)。64株CRAB中有46株(71.88%)來自于痰，5株來自于血(7.81%)和4株來自于尿(6.25%)等。所有菌株均表現為多重耐藥，耐藥情況見表2。

表2 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率(%)

Table 2 Resistance rates of CRAB to commonly used antimicrobial agents (%)

抗菌藥物南昌大學第一附屬醫院(n=55)南昌大學第二附屬醫院(n=5)江西省人民醫院(n=4)合計氨芐西林/舒巴坦96.36100.0075.0095.31哌拉西林/他唑巴坦94.55100.00100.0095.31頭孢他啶98.18100.00100.0098.44亞胺培南100.00100.00100.00100.00慶大霉素89.09100.00100.0090.63妥布霉素76.36100.0075.0078.13環丙沙星98.18100.00100.0098.44左氧氟沙星50.9180.0075.0054.69

2.2 碳青霉烯酶和金屬酶表型檢測結果 64株CRAB菌株改良Hodge試驗陽性49株，陽性率為76.56%；亞胺培南EDTA協同試驗陽性62株，陽性率為96.88%。見圖1。

A為改良Hodge試驗，其中標注1為陽性對照，2為陰性對照，3為陽性結果；B為EDTA協同試驗，其中標注1為亞胺培南紙片，2為亞胺培南+EDTA

圖1 改良Hodge試驗與EDTA協同試驗結果

Figure 1 Results of modified Hodge test and EDTA-disk synergy test

2.3 耐藥基因檢測結果 64株臨床分離的CRAB，87.50%(56株)攜帶OXA-23、VIM-1基因，3.13%(2株)攜帶OXA-24基因，18.75%(12株)攜帶SIM基因，26.56%(17株)攜帶NDM-1基因，所有菌株檢出OXA-51基因，所有菌株均未檢出KPC、SME、GES、SPM、GIM、IMP1、VIM-2、OXA-58基因。部分電泳和測序結果見圖2～4。

1泳道: Marker;2—7泳道分別為NDM-1、NDM-up-dw、OXA-23、VIM-1、SIM、OXA-24基因陽性

圖2 鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因PCR擴增產物瓊脂凝膠電泳圖

Figure 2 Agarose gel electrophoresis map of PCR amplification products ofA.baumanniicarbapenemase genes

1泳道為Marker;2泳道為OXA-51基因陽性

圖3 鮑曼不動桿菌OXA-51基因PCR擴增產物瓊脂凝膠電泳圖

Figure 3 Agarose gel electrophoresis map of PCR amplification product ofA.baumanniiOXA-51 gene

圖4 鮑曼不動桿菌NDM-1金屬酶基因的部分測序圖

2.4NDM-1基因的檢測、測序及接合試驗NDM-1陽性CRAB中64.71%(11/17)表現為泛耐藥，同時多攜帶其他碳青霉烯酶基因。接合試驗結果表明，接合子帶有與供體菌相同的NDM-1基因，且同時獲得對亞胺培南、頭孢他啶、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素的耐藥性并穩定傳遞，接合子對環丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素敏感，接合傳遞實驗使得接合子的耐藥性增加。攜帶NDM-1基因的CRAB均來自于南昌大學第一附屬醫院。見表3。

表3 17株產NDM-1菌株的耐藥譜及耐藥基因攜帶情況

ABPC/SB：氨芐西林/舒巴坦；CIP：環丙沙星；LVX：左氧氟沙星；GM：慶大霉素；TOB：妥布霉素；IMP：亞胺培南；MER：美羅培南

3 討論

碳青霉烯類抗生素由于對β-內酰胺酶高度穩定，與青霉素結合蛋白親和力強，并能夠有效滲透細菌外膜進入周質間隙，從而具備抗菌譜廣，殺菌活性強的特點，是目前抗菌活性最強，殺菌速度最快的一類抗生素。碳青霉烯類抗生素對不動桿菌有較好的抗菌活性，是治療不動桿菌重癥感染的首選藥物。鮑曼不動桿菌一旦對碳青霉烯類抗生素耐藥，將給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰[8]。本研究中收集的CRAB主要來源于重癥患者，所有菌株均表現為多重耐藥，部分甚至出現泛耐藥，與全球報道的情況基本一致[9]，可能與CRAB對碳青霉烯類抗生素的多種耐藥機制可同時導致其對其他抗菌藥物耐藥有關[7]。

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥主要是由于產碳青霉烯酶、主動外排系統、膜孔蛋白的缺失和青霉素結合蛋白的改變等，其中最主要的原因為產碳青霉烯酶。碳青霉烯酶包括Ambler分類的A、B和D類，國內報道較多的為D類的OXA-23和B類的IMP等。OXA-23是全球流行最廣泛的碳青霉烯酶，且產OXA-23的鮑曼不動桿菌是引起醫院感染暴發的主要病原菌[10]。

本組64株CRAB， 87.50%攜帶OXA-23、VIM-1基因，3.13%攜帶OXA-24基因，18.75%攜帶SIM基因，所有菌株均未檢出KPC、SME、GES、SPM、GIM、IMP1、VIM-2、OXA-58基因。國內淮河以北地區鮑曼不動桿菌檢出IMP和VIM基因[11]；國外報道，多個地區鮑曼不動桿菌檢出IMP、VIM及SIM基因[12-14];之前研究顯示，本地區主要是攜帶OXA-23基因的鮑曼不動桿菌，未發現金屬酶基因，與此次研究結果差異較大。本研究結果發現OXA-23和VIM-1為江西地區CRAB的主要碳青霉烯酶基因。

NDM-1基因在國內偶見報道，NDM-1是科學家發現的一種新的超級耐藥基因，編碼一種新的耐藥酶，NDM-1全稱為“新德里金屬β-內酰胺酶1”，是一種高效酶，能水解除氨曲南以外的所有β-內酰胺類藥物[15]，因此，攜帶NDM-1基因的細菌表現為廣泛耐藥，攜帶NDM-1基因的主要菌種有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞等[16-19]。本研究64株CRAB中，有26.56% (17株) 攜帶NDM-1基因，國內浙江和廣東等地也在CRAB中檢出NDM-1基因[6,20]，但在此之前，本地區尚未有CRAB菌株中檢出NDM-1基因的報道。攜帶NDM-1基因的CRAB均來自于南昌大學第一附屬醫院，其中64.71%(11/17)的菌株表現為泛耐藥，其他菌株也為多重耐藥菌，可能與NDM-1基因的表達低有關。攜帶NDM-1基因的菌株多同時攜帶其他碳青霉烯酶基因，與Chatterjee等[21]的研究一致。根據耐藥表型及攜帶耐藥基因的情況，將本組NDM-1基因陽性菌株分為9種類型，其中菌株4、8、23、25、28、36號及菌株14、19、20號表型基本一致，推測可能存在NDM-1基因醫院內的克隆傳播。

為探討NDM-1基因的傳播途徑，將攜帶NDM-1基因的CRAB作為供體菌，疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53作為受體菌進行接合試驗，在篩選平板上獲得了攜帶NDM-1基因并對亞胺培南耐藥的接合子。由此證實，NDM-1基因可通過質粒在不同菌株間進行傳遞。以往研究中，我們證實了質粒在多重耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染的暴發中起著非常關鍵的作用[22]。

本研究中，改良Hodge試驗陽性菌株49株，陽性率為76.56%，與PCR擴增結果存在一定的出入，可能與CRAB碳青霉烯酶表達量低有關；EDTA協同試驗陽性率為96.88%，與PCR擴增結果基本一致，可見EDTA協同試驗是較好的判斷碳青霉烯酶基因攜帶的方法。

總之，本地區CRAB對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要碳青霉烯酶基因型為OXA-23和VIM-1，部分菌株中檢出NDM-1基因。臨床應加強對CRAB的監測，同時加強對抗菌藥物使用的管理，積極預防和控制醫院內CRAB的播散。

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(本文編輯：孟秀娟)

NDM-1 gene and other carbapenemase genes inAcinetobacterbaumanniiin Jiangxi area

CHENJiao1,WUXiu-zhen1,LIUKang1,HUXue-fei2,CHENKai-sen2,ZHANGLi-ming3,CHENHe3

(1JiangxiHealthVocationalCollege,Nanchang330052,China；2TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China; 3TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Objective To understand the carriage ofNDM-1 and other carbapenemases in carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii(CRAB) in Jiangxi area, and provide laboratory basis for the prevention and control of healthcare-associated infection (HAI). Methods Sixty-four strains of CRAB isolated from clinical specimens from 3 tertiary first-class hospitals in Jiangxi area from January 2015 to June 2016 were collected, susceptibility to commonly used antimicrobial agents were detected with Kirby-Bauer method. Carbapenemases and metalloenzyme in CRAB were screened with modified Hodge test and EDTA-disk synergy test respectively, carbapenems gene was detected by polymerase chain reaction (PCR)，NDM-1-producingAcinetobacterbaumannii(A.baumannii) were performed conjugation test.Results The resistance rates of CRAB to ampicillin/sulbactam, ciprofloxacin, gentamicin, and levofloxacin were up to 95.31%, 98.44%, 90.63%, and 54.69% respectively. The positive rates of modified Hodge test and EDTA-disk synergy test were 76.56% and 96.88% respectively. PCR amplification result showed that 87.50%(n=56) of CRAB carriedOXA-23 andVIM-1 genes，18.75%(n=12)carriedSIM， 3.13%(n=2)carriedOXA-24，and 26.56%(n=17) carriedNDM-1. CRAB carryingNDM-1 gene were all from The First Affiliated Hospital of Nanchang University, 64.70%(11/17)of which were pandrug-resistant strains. Conjugation test result showed thatNDM-1-producing strains could transferNDM-1 gene to recipient strainEscherichiacoliJ53, then acquired resistance to imipenem. Conclusion Antimicrobial resistance rates of clinically isolated CRAB in this area are high,OXA-23 andVIM-1 genes are the main carbapenemase genes,NDM-1 gene positive CRAB is detected, and there may be a clonal spread ofNDM-1 gene in hospital, effective measures should be taken as soon as possible to prevent and control the spread ofNDM-1 positive CRAB.

Acinetobacterbaumannii； multidrug resistance； carbapenemase gene; healthcare-associated infection

2016-09-06

江西省科技廳科技計劃項目(20142BBG70021)

陳嬌(1987-)，女(漢族)，江西省南昌市人，主管技師，主要從事微生物耐藥機制的研究。

陳嬌 E-mail：jochenjin@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.003

R378.99 R446.5

A

1671-9638(2017)02-0109-06