細菌對利福平耐藥機制研究進展

徐凱悅(XU Kai-yue)，強翠欣(QIANG Cui-xin)，趙建宏(ZHAO Jiang-hong)

(河北醫科大學第二醫院 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000)

·綜述·

細菌對利福平耐藥機制研究進展

徐凱悅(XU Kai-yue)，強翠欣(QIANG Cui-xin)，趙建宏(ZHAO Jiang-hong)

(河北醫科大學第二醫院 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000)

利福平； 耐藥機制； RNA聚合酶； 利福平耐藥決定區； rpoB

利福霉素為袢霉素類家族成員，可用于治療多種感染，如結核病、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染、艱難梭菌引起的艱難梭菌相關性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea, CDAD)、衣原體的持續感染[1]、旅行者腹瀉[2]等。然而，利福霉素廣泛用于臨床感染治療的同時，細菌耐藥問題卻使該殺菌“利器”變得“鈍化”。結核分枝桿菌極易對利福平(rifampin, RIF)耐藥，約有3.6%新增結核病和20.2%復治結核病為耐多藥結核病[3]。CDAD是成人醫院獲得性腹瀉的主要原因[4]，利福霉素類中利福昔明因其口服不易被吸收，用于治療復發性CDAD[5]，然而艱難梭菌對利福霉素耐藥率高達11%[6]。如何在正常發揮藥物抗菌作用的同時減少細菌耐藥的產生，關系臨床抗感染治療的成敗。本文在介紹RIF抗菌機制的基礎上，對細菌耐RIF的機制予以綜述，為臨床開發新的細菌轉錄抑制劑類藥物提供幫助，以便更加有效的治療感染。

1 RIF抗菌機制

因此，細菌可通過β亞基的編碼基因—rpoB突變，造成氨基酸的改變，導致對RIF親和力降低，進而對RIF耐藥。然而作用靶點突變并不是唯一的耐藥機制，其他耐藥機制亦有報道，如對藥物的修飾滅活作用、膜通透性改變、外排泵等。

2 rpoB突變是細菌對利福平耐藥(RIFr)主要機制

有關大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和結核分枝桿菌等細菌對RIF的耐藥機制已有報道，其中最常見且可引起高水平耐藥的機制為rpoB突變。

由于RNAP在細菌中較為保守，因此RIFr株的rpoB突變位點也較保守，故常將其他細菌的突變位點與大腸埃希菌相應序列進行比對。本文涉及不同細菌耐藥突變位點時，除非有特別說明，一律使用大腸埃希菌β亞基氨基酸的相應位點進行描述。

2.1 大腸埃希菌RIFr盡管大腸埃希菌感染不在RIF的適應證范圍，但大腸埃希菌為細菌研究的模式菌株，且該菌轉錄起始及終止過程研究也較為詳盡。20世紀80年代，Jin等[8]對引起大腸埃希菌RIFr的rpoB位點突變進行研究，結果發現耐藥突變位點位于rpoB的中部，分為三個區域：cluster I(507-533位氨基酸)，cluster II(563-572位氨基酸)，cluster III(687位氨基酸)。rpoB中所包含這些耐藥突變的區域稱為利福平耐藥決定區(rifampin resistance determing region, RRDR)。上述提到的水生棲熱菌RNAP中與RIF存在氫鍵或范德華力的12個氨基酸，均位于RRDR cluster I—II中，且除E445(水生棲熱菌RpoB蛋白編碼)外，其他11個氨基酸的突變均可引起RIFr[7]。此外，還有一個靠近β亞基N端的區域(N cluster)，其突變亦可導致RIFr。研究[9]發現，大腸埃希菌RIFr株β亞基第146位氨基酸存在替換，而該位點位于cluster I—III外。隨后， Severinov等[10]通過基因定點突變方法，證實了rpoB N cluster(143-148位氨基酸)突變可導致RIFr。

正如Jin等[8]所假設的，核心酶中β亞基各部分間似乎通過彼此合作形成RIF結合區。利用某些間接方法，我們可知大腸埃希菌RNAP活性中心及其與RIF結合位點相互作用的拓撲結構，如將聚合酶-啟動子復合物與β亞基交聯到一起后，進行限制性酶解和化學降解，發現RRDR中的cluster I參與活性中心的形成[11]。

2.2 結核分枝桿菌RIFr結核分枝桿菌為緩慢生長菌，其鑒定及傳統藥敏試驗約需12周，時間長，使得患者早期不能得到個性化的治療，增加耐藥株出現的風險。而RIFr為耐多藥結核的一個可靠標志，到目前為止，大部分RIFr結核分枝桿菌同時也對異煙肼耐藥[12]。因此，盡可能全面地了解結核分枝桿菌中與RIFr有關的rpoB突變，有利于從分子角度快速檢測耐藥株。

結核分枝桿菌RIFr突變主要集中在rpoB中一個長度為81bp(β亞基第507-533位氨基酸，位于cluster I內)的熱點突變區中，稱為結核分枝桿菌的RIFr決定區。報道顯示，約95%的結核分枝桿菌RIFr突變位于該區內[13]，其中第516、526和531位氨基酸替換最多見[14]。Jamieson等[15]在2株耐多藥結核分枝桿菌中發現V146F替換，而該位點位于大腸埃希菌rpoB N cluster(β亞基第143-148位氨基酸)，同樣引起RIFr[10]。

了解結核分枝桿菌RIFr株的rpoB突變情況，有助于利用分子方法快速檢測疑似感染患者體內的結核分枝桿菌及其耐藥性。現已有多種快速檢測結核分枝桿菌RIFr株的方法，如高分辨率溶解曲線分析[16]以及基于鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)探針的實時PCR技術[17]等。2013年美國食品藥品管理局(FDA)批準了一種商品化的基于PCR法檢測痰標本中結核分枝桿菌DNA的試劑盒，可同樣檢測RIFr株[18]。

2.3 艱難梭菌RIFr艱難梭菌是專性厭氧革蘭陽性芽孢桿菌, 被認為是引起抗生素相關性腹瀉的主要病原菌之一，嚴重感染者可發生假膜性腸炎、腸壞死甚至死亡。近年由于艱難梭菌高產毒株(027/NAP1/BI型)在世界多個地區的暴發流行，使艱難梭菌成為醫院獲得性腹瀉的主要病原菌[19]。利福霉素類抗生素，尤其是利福昔明可用于治療復發性CDAD[5]。然而，艱難梭菌對利福霉素的耐藥時有發生。據現有文獻[6]估計，艱難梭菌對RIF的耐藥率達11%，且有升高趨勢。Freeman等[20]對歐洲22個國家艱難梭菌耐藥監測發現，17個國家出現RIFr艱難梭菌，尤其是意大利、捷克、丹麥和匈牙利出現了高比率耐藥(57%～64%)。有報道[21]指出，利福霉素暴露是患者發生耐藥艱難梭菌感染的危險因素之一，甚至在用利福霉素治療期間就可發生耐藥艱難梭菌感染[22]。面對日益嚴峻的耐藥形勢，了解其耐藥機制尤為重要。目前認為艱難梭菌RIFr通常與rpoB突變有關，涉及的氨基酸替換為第502、505、548、488、492和498位(艱難梭菌RpoB蛋白編碼)等，大多對應于RRDR cluster I，其中第502、505位氨基酸替換最為多見[21,23-27]。

3 其他RIFr機制

除上述耐藥機制之外，某些菌屬本身的RNAP對RIF不敏感，如密螺旋體屬、疏螺旋體屬、端螺旋體屬和一些土壤放線菌，原因在于其rpoB第531位的密碼子為天冬酰胺而非敏感菌屬中的絲氨酸[28]。

除rpoB突變外，細菌可通過其他方式對RIF產生低水平耐藥，如RNAP結合蛋白的保護作用、對RIF修飾滅活、膜通透性改變和外排泵的過度表達等。

天藍色鏈霉菌可耐受低濃度RIF，Newell等[29]研究顯示其RNAP結合蛋白RbpA介導該菌的低水平耐藥，另外，該研究發現在結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和白喉棒狀桿菌中亦存在rbpA同源基因。近來有研究[30]顯示，結核分枝桿菌RbpA通過間接的方式介導耐藥，并不影響RNAP對RIF的敏感性，而是調整RNAP核心酶結構，增加核心酶對σA的親和性，加速σA指導的轉錄，從而產生耐藥。同時，研究發現，RbpA結合于RNAP β亞基Sandwich-Barrel Hybrid模體上，且該區域并不與RIF結合位點重合。DnaA蛋白可與RNAP結合，在一定程度上削弱RIF對RNAP的抑制作用[31]。Dey等[32]經體內及體外研究證實，恥垢分枝桿菌MsRbpA蛋白可與RNAP β亞基相互作用，提高RNAP對RIF的耐受水平，介導低水平耐藥，同時該研究發現MsRbpA同源體保守存在于分枝桿菌屬中。Weiss等[33]研究顯示，在結核分枝桿菌中削弱CarD/RNAP β亞基的相互作用可增加該菌對RIF敏感性。

某些細菌可通過對RIF修飾使其失活從而產生耐藥。常見的修飾方式為糖基化、核糖基化、磷酸化和脫色效應，其中脫色效應與單加氧酶有關[34]。在敲除皮疽諾卡菌rpoB2后，單加氧酶介導的脫色效應成為其耐藥的主要方式[35]。恥垢分枝桿菌可使RIF核糖基化而對其天然耐藥，該菌表達的Arr蛋白具有單ADP-核糖基轉移酶作用，催化利福霉素類藥物ADP-核糖基化，使其失活[36]。此外，該研究發現，arr同源基因廣泛存在于環境細菌及嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、天藍色鏈霉菌和谷氨酸棒狀桿菌等細菌中。研究[37]顯示，對RIF同系物C25位修飾后可抵抗恥垢分枝桿菌ADP-核糖基轉移酶對其滅活作用。Spanogiannopoulos等[38]從環境放線菌中分離出1株RIFr放線菌—WAC1438，發現其可對RIF進行糖基化失活，rgt1438為其糖基轉移酶編碼基因。1994年研究[39]發現,細菌可以通過磷酸轉移酶將RIF磷酸化而失活，然而，直到最近才有研究揭示了放線菌中該酶的編碼基因rph[40]。該研究同時發現rph上游的一段保守序列——利福平相關元件(RAE)，該序列與RIF滅活酶編碼基因有關。同時研究指出，RIF敏感菌中亦存在rph同源基因，如產單核細胞李斯特菌和臘樣芽孢桿菌。近來，Qi等[41]獲得產單核細胞李斯特菌RIF磷酸轉移酶(LmRPH)在不同催

另外，細菌還可通過降低膜通透性、調節外排泵或膜通道蛋白的表達而耐藥。分枝桿菌屬細菌由于其獨特的富于脂質的細胞壁結構導致膜通透性低，因而對多種抗生素天然耐藥。有研究[43]顯示，恥垢分枝桿菌細胞壁中Wag31-AccA3與胞壁脂質的通透性和對親脂性藥物(如RIF)耐藥有關，敲除Wag31后胞壁對親脂性分子通透性增強，對RIF敏感性增加，AccA3過度表達則結果反之。許多細菌外排泵可將RIF排至細胞外，導致低水平耐藥,如結核分枝桿菌[44-45]。波賽鏈霉菌可產生2種抗腫瘤分子——阿霉素和道諾霉素，其drrAB編碼的DrrAB外排系統，屬ABC結合盒類轉運體，可將該2種分子排至細胞外。近有研究[46]顯示，該轉運體為多藥轉運體，RIF為其底物之一。恥垢分枝桿菌中，marRAB操縱子編碼兩種ABC結合盒類轉運體，MarR蛋白通過調節marRAB操縱子的表達，進而影響細菌對RIF的耐藥性。與其他外排泵不同的是，該菌中此2種ABC結合盒類轉運體過度表達反而增加細菌對RIF的敏感性，因此，該菌中的MarR蛋白為阻遏蛋白，抑制marRAB操縱子的表達，產生耐藥[47]。此外，某些細菌可通過膜表面通道蛋白的表達調節對RIF的耐藥性。Danilchanka等[48]研究顯示，牛分枝桿菌卡介苗膜通道蛋白CpnT的編碼基因cpnT的突變，可導致RIFr，與此同時，研究人員認為該CpnT膜通道蛋白可能與臨床分離的無法用已知耐藥基因突變解釋的結核分枝桿菌耐藥有關。

4 總結與展望

rpoB RRDR堿基突變是細菌對RIF呈高水平耐藥的主要機制。此外，細菌對RIF的共價修飾、RNAP結合蛋白的保護作用以及外排泵的過度表達等亦為細菌對RIFr的機制。對耐藥機制的研究有助于優化治療，減少耐藥的產生，如外排泵抑制劑與利福霉素的聯合應用或許可縮小單藥對細菌的耐藥突變選擇窗，有利于減少耐藥的產生；對利福霉素某些位點進行改造，抵抗滅活酶的修飾；根據細菌rpoB耐藥突變情況，優化或開發新的利福霉素等。

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(本文編輯：熊辛睿)

Advances in rifampin resistance mechanism in bacteria

(The Second Hospital of Hebei Medical University Hebei Provincial Center for Clinical Laboratories, Shijiazhuang 050000, China)

2016-08-20

河北省自然科學基金(H2013206450)；河北省科技廳基礎條件平臺建設項目(10966142D)；河北醫科大學第二醫院科研基金(2h2201605)

徐凱悅 (1990-)，女(漢族)，河北省石家莊市人，檢驗師，主要從事細菌感染性病原體的檢測與流行病學研究。

趙建宏 E-mail：zhaojh_2002@yahoo.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.021

R378

A

1671-9638(2017)02-0186-05