小膠質細胞內的鈣離子信號的研究進展

孟雪蓮，劉佳，陳長蘭

(遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036)

小膠質細胞內的鈣離子信號的研究進展

孟雪蓮，劉佳，陳長蘭*

(遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036)

細胞內鈣離子(Ca2+)對多種生理活動均具有一定的調節作用，它可影響神經遞質釋放和細胞興奮性.細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)受到多方面調控，[Ca2+]i的變化是重要的信號轉導方式之一.小膠質細胞是中樞神經系統中固有的免疫細胞，它們對腦損傷、腦炎癥和多種神經退行性疾病有先天性的免疫應答.除了在疾病發生發展中的作用，小膠質細胞也在很大程度上參與了神經元網絡的發育和腦組織穩態的維持.受體介導的鈣離子信號的傳遞，是包括小膠質細胞在內的所有細胞中最普遍的信號轉導機制.小膠質細胞功能變化與小膠質細胞內鈣離子信號的變化密切相關，對小膠質細胞內鈣離子信號的研究具有重大的意義.

小膠質細胞；鈣離子；神經退行性疾病

0 引言

神經退行性疾病(Neurodegenerative Disease，NDD)是一類以神經元退行性病變為特征的慢性、進行性神經系統疾病，主要包括阿爾茨海默病(Alzheime′s Disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)、肌萎縮側索硬化癥(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)等.神經退行性疾病是典型的老年病，已引起廣泛關注.調查發現，長期服用非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的老年人患AD的發生率顯著降低，NSAIDs是目前研究最多的抑制小膠質細胞活化的藥物之一.已有實驗結果顯示，NSAIDs可顯著減少AD模型動物腦內激活的小膠質細胞的數量，減輕中樞炎癥，發揮抗AD作用[1].小膠質細胞作為腦內的免疫細胞，在神經退行性疾病中起關鍵作用.小膠質細胞可通過表達多種受體，來識別不同的危險信號并做出反應.大量的實驗表明，小膠質細胞的功能與細胞內Ca2+水平密切相關.小膠質細胞上的一些受體激活可引起細胞中游離鈣離子濃度增高，小膠質細胞的過度活化與其胞漿鈣離子水平的增高直接相關[2]，而過度激活的小膠質細胞可導致神經元嚴重變性死亡，引起腦損傷[3-4].然而，目前對于小膠質細胞內Ca2+信號仍知之較少.本文將主要介紹小膠質細胞內鈣離子信號的研究進展.

1 小膠質細胞

小膠質細胞是一種免疫細胞，在中樞神經系統(CNS)中最具代表性，其在不同腦區域的密度不同，其中，在腦灰質中的密度最高[5].小膠質細胞大約占腦細胞的12%[6]，神經膠質細胞(Neuroglia)的20%.目前，關于小膠質細胞的起源仍存在一些爭論，現在普遍接受的觀點是小膠質細胞起源于外周的骨髓細胞，在胚胎形成時骨髓的前體細胞(myeloid precursor cells)進入到CNS中并分化形成了小膠質細胞[7].

在發育成熟的腦中，呈分枝狀的靜息態小膠質細胞被認為是感應細胞[8-9]，可監測腦內異常變化.小膠質細胞在腦損傷或免疫刺激等傷害的刺激下可被激活.小膠質細胞激活后，形態從分枝狀轉變為阿米巴樣.同時，細胞表面的一些分子，包括CD14、主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)分子、趨化因子受體等表達水平上調[5,10].小膠質細胞的激活發生在中樞神經系統受損傷的部位，如嚴重的中樞神經系統損傷、腦癌、腦細胞壞死、感染、腦缺血和神經退行性疾病(如阿爾茨海默癥，帕金森癥、HIV癡呆等)可使小膠質細胞激活[11].

2 小膠質細胞活化

適度激活的小膠質細胞對神經元具有保護作用，它會對病理變化做出吞噬細胞碎片、分泌生長因子和抵御外來的侵襲等不同的適應性反應[12].在阿爾茲海默癥病變的過程中可以減少細胞碎片或錯誤折疊的蛋白如淀粉樣蛋白β(Aβ)[13].激活的小膠質細胞能夠合成并釋放抗炎因子和神經保護因子，例如，腦衍生的神經保護因子(BDNF)、轉化生長因子-β(TGF-β)或白細胞介素-10(IL-10)，對周圍的組織存在有益作用[14-15].此外，小膠質細胞可能參與了發育成熟腦內的神經發生過程[16].

然而過度激活的小膠質細胞釋放大量的神經毒性因子[17]，如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等[18-19]，導致阿爾茨海默氏病、帕金森病等神經退行性疾病的發生[20].過度活化的小膠質細胞可以導致嚴重的神經損傷，這已經成為了被廣泛接受的事實[21].

3 鈣離子

鈣是體內含量最多的元素之一，是骨骼組織的主要組成部分，約占機體質量的2%[22].Ca2+參與細胞增殖、分化、生長、衰老等生命活動的信息傳遞與調控，并在各種生理活動(如肌肉興奮收縮、血管緊張度調節、神經沖動傳導等)中起著十分重要的作用，它是生物體內重要的信使物質，且分布廣泛，許多重要疾病的發生和發展是由于其代謝的變化和信號的異常導致.

鈣離子可通過多種途徑進出細胞，并且通過作用于各種Ca2+感受器從而激活下游分子來調節細胞的分泌和活化.鈣離子的多數生理功能是通過與鈣調蛋白(calmodulin，CaM)形成復合物來實現的[23].

4 小膠質細胞中鈣離子的跨膜轉運

1)小膠質細胞中的鈣離子內流細胞外鈣離子能夠經過細胞膜上的鈣離子通道進入細胞內.原則上，小膠質細胞的鈣離子內流存在三種機制[24]：①配體結合觸發的鈣離子跨膜流動，即受體門控性鈣通道(ROCs)；②細胞膜去極化激活電壓門控性鈣通道(VOCs)導致的鈣內流；③當細胞內鈣離子耗竭，為了補充鈣離子不足，儲存開啟性鈣通道(SOCs)開放，促使鈣離子大量內流.

2)小膠質細胞中的鈣離子外排在所有真核細胞中，質膜上的ATP依賴性鈣離子泵維持著鈣離子跨膜濃度梯度.ATP依賴性鈣離子泵使小膠質細胞外鈣離子濃度遠遠高于細胞內(約為105倍)，這使得[Ca2+]i無論短暫的還是長期的改變，均可啟動下游的信號轉導.在小膠質細胞內鈣超載的情況下，Na+/Ca2+交換體可協助鈣離子泵將鈣離子從細胞中排出[25].

3)小膠質細胞鈣庫中鈣離子的釋放細胞內鈣離子主要貯存在內質網(ER)或肌質網(SR)中，是細胞內主要的鈣庫.小膠質細胞內鈣離子釋放通道主要為1,4,5-三磷酸肌醇(InsP3)受體，即InsP3R家族.細胞膜上相關受體激動，可使細胞中InsP3增加，作用于InsP3Rs，進一步導致細胞內鈣庫中的鈣離子釋放[26].簡言之，G蛋白偶聯受體(GPCRs)或受體蛋白激酶(RPKs)可激活特定亞型的磷脂酶C(PLC)，使4,5-二磷酸肌醇轉變為三磷酸肌醇和二酰甘油(DAG).三磷酸肌醇作為第二信使，與內質網上的InsP3Rs結合，使鈣庫中的鈣離子釋放.還有一種受體通道.

4)小膠質細胞中鈣離子的貯存除了將鈣離子從細胞質排出到細胞外，還可以將細胞質中鈣離子攝入內質網或者線粒體內.通過內質網上的肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA)可以補充內質網鈣庫中的鈣離子不足[27]，這在G蛋白/InsP3介導的鈣離子信號傳導中起到關鍵作用.在小膠質細胞內鈣離子濃度增高時，線粒體可作為鈣離子儲存器或緩沖器，并且可能在SOCs的調節中發揮作用.

5 靜息態小膠質細胞中的鈣離子

在未激活的小膠質細胞中，[Ca2+]i的變化是重要的信號轉導途徑之一.小膠質細胞中[Ca2+]i受到多種機制的嚴格調控[28].當[Ca2+]i發生改變，細胞膜上表達多種不同的離子型和代謝型受體[29].除此之外，[Ca2+]i的增高與小膠質細胞執行的功能密切相關，例如釋放前炎癥因子、抗炎癥因子、一氧化氮和營養因子等[30].然而，這些數據主要是從體外實驗獲得的，目前，對原位或體內小膠質細胞的鈣離子信號知之甚少.

6 活化的小膠質細胞中的鈣離子

作為腦內的巨噬細胞，小膠質細胞必須以適當的方式發現危險信號并做出反應.研究表明，小膠質細胞可表達多種受體，用以識別不同的危險信號.在這些危險信號中，補體因子、緩激肽、血小板活化因子、凝血酵素、前列腺素、甲酰肽(fMLP)、LPA(lysophosphatidylic acid)、趨化因子、前炎癥因子均可引起小膠質細胞中[Ca2+]i增高[4].多項研究結果表明，激活的小膠質細胞中[Ca2+]i持續增高，其升高一方面來自胞內Ca2+庫的釋放，另一方面來自胞外Ca2+的內流.以脂多糖(LPS)[31]或Aβ[32]激活體外培養的大鼠或人胚胎小膠質細胞中，可觀察到[Ca2+]i的持續增加.同樣，從AD病人腦中分離的小膠質細胞基礎離鈣離子濃度亦顯著高于正常人[32].腦內Aβ激活的小膠質細胞中Ca2+依賴的神經毒性物質的釋放與AD的發生密切關聯[33].此外，研究認為激活的小膠質細胞釋放NO、細胞因子、趨化因子均需要[Ca2+]i的提高[34].

P2X7受體激動劑BZ-ATP可激活小膠質細胞，使[Ca2+]i增高.已有研究表明，P2X7受體在AD腦中在AD病人腦中小膠質細胞介導的嘌呤炎癥反應中發揮起重要的作用[35].在AD大鼠腦內的小膠質細胞中P2X7受體表達量比正常非癡呆(ND)大鼠腦內小膠質細胞中的表達量增高.在ATP激動劑作用下，通過P2X7受體的介導，原代培養的小膠質細胞會逐漸發生形態上的變化，同時受體表達會逐漸增加.在ATP持續刺激下，小膠質細胞逐漸凋亡.

FPRL1受體在AD腦部炎癥反應中發揮重要作用.甲酰肽受體(FPRL1)激動劑fMLP可使小膠質細胞激活，[Ca2+]i增高[36].研究表明，Aβ1-42可通過作用于FPRL1而誘導小鼠小膠質細胞趨化移動，并可通過抑制FPR2 (人FPRL1在小鼠的同源受體)的表達，而抑制Aβ1-42誘導的小膠質細胞激活，同時Aβ1-42還可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子和趨化因子MCP-1的釋放[37].

7 活化的小膠質細胞中的鈣調蛋白

鈣通道的鈣依賴性易化(Ca2+-dependent facilitation,CDF)和鈣依賴性失活(Ca2+-dependentinactivation,CDI)都是由鈣調蛋白(CaM)介導的.目前認為CaM是鈣依賴性調節過程中的Ca2+感受器.因此鈣調蛋白對鈣離子通道的開放非常重要[38].

CaM分子量為17.6kD，由148個氨基酸組成，空間結構呈亞玲狀，兩端(N端，C端)膨大呈球形，中間由細長的α螺旋結構連接，兩端各有兩個Ca2+結合位點[39]，其中C端與Ca2+的親和力是N端的10倍.當Ca2+與CaM結合形成復合物時，CaM由原來松散的結構變成緊密的螺旋結構并暴露疏水區，成為 Ca2+-CaM依賴性靶酶的結合部位[40].CaM的一級結構極為保守，已證實動物、植物以及低級真核生物所得到的CaM氨基酸組成及排列基本相同.它本身無活性，但能改變多種靶蛋白的構象，包括酶、膜轉運蛋白等，其中最重要的是Ca激酶，包括蛋白磷酸化酶、脫磷酸酶和鈣轉移酶等[41].鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一種絲/氨酸蘇氨酸蛋白激酶，將某些底物磷酸化而改變其活性，CaMKⅡ的活化需要Ca2+/CaM的啟動，CaM和CaMKⅡ同時參與鈣離子通道的鈣依賴性調節過程.鈣通道蛋白的CaMKⅡ磷酸化對L型鈣通道(目前最具藥理學意義的一類鈣通道，通道被激活后持續時間長，失活慢)的CDF起決定性作用.進一步的研究表明，CaMKⅡ與alc亞基(L型鈣通道的主要功能單位之一)C末端的相互作用對CDF是必需的，在Ca2+介導下，CaMKⅡ緊緊結合于通道的alc亞基上，起到鈣峰率檢測器作用.

研究表明，經紅藻氨酸處理的小鼠海馬組織中，激活的小膠質細胞內CaM的表達顯著增高[42].研究發現，由LPS誘導的炎癥反應包含Ca2+介導的信號調節.將RAW264.7細胞暴露給LPS能夠引起CaM的快速增加，而CaM與炎癥反應的調節密切相關.隨著CaM的增加，關鍵轉錄因子(如NF-κB p65亞基，磷酸化的c-Jun，Sp1)向細胞核內定位移動，致炎細胞因子TNF-α和iNOS跟著增加.通過穩定轉染CaM增加細胞內CaM的水平，導致LPS誘導的TNF-α和iNOS表達的減少，同時伴隨著他們的轉錄調節因子活化的減少.因此在Ca2+依賴的信號調節過程中，CaM對控制LPS處理細胞過程中所導致的致炎因子表達能起至關重要的作用[43].近期研究也證實，在LPS激活的BV-2小膠質細胞中，抑制Ca2+-CaMKⅡ/TAK1-NF-κB信號通路，可使iNOS表達降低，NO生成減少[44].

綜上所述，小膠質細胞與阿爾茨海默病、帕金森癥等神經退行性疾病的病理進程有重要的關聯.調節小膠質細胞功能狀態，增強它的保護作用，減弱、抑制它的炎癥反應，有利于疾病的預防和治療.鈣離子信號參與了小膠質細胞的多種功能調控.通過多年研究，鈣離子信號的傳遞對小膠質細胞功能的影響已取得了很大的進展，但許多問題仍存在爭議.因此小膠質細胞內鈣離子水平的變化及其信號轉導通路值得進行更深入的研究，在防治炎癥相關的中樞神經退行性疾病中具有重要的研究價值.

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(責任編輯 李 超)

Calcium Signaling in Microglia

MENG Xue-lian,LIU Jia,CHEN Chang-lan*

(SchoolofPharmaceuticalsciences,LiaoningUniversity,Shenyang110036,China)

Intracellular calcium(Ca2+) has the regulation to a variety of physiological activities.It can affect the release of neurotransmitter and the excitability of cell.Intracellular calcium concentration([Ca2+]i) subject to many regulatory,the change of [Ca2+]iis one of the most important pathways of signal transduction.Microglia are inherent immune cells in the central nervous system.They have innate immune response to brain injury,brain inflammation and a variety of neurodegenerative diseases.In addition to roles in disease development,microglia are also heavily involved in the development of neural networks and the homeostasis of neural network.Receptor-mediated calcium signaling transfer is the most common signal transduction mechanisms in all cells,including microglia.The functional changes of microglia are closely related to the changes of calcium signaling in microglia,and it is of great significance for the study of microglia calcium signal.

microglia; calcium; neurodegenerative diseases

2016-07-05

國家自然科學基金項目(81503085，31371085)；遼寧省自然科學基金項目(2014020171)；遼寧大學教改項目(JG2016YB0052)

孟雪蓮(1978-)，女，遼寧沈陽人，博士，副教授，從事藥理學研究，E-mail：rubymxl@163.com.

*通訊作者：陳長蘭(1963-)，教授，E-mail:chenchanglanbio@aliyun.com.

R 967

A

1000-5846(2017)01-0034-07