沉默Versican基因對鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6體外增殖及遷移影響的研究*

李之曦， 王 力， 劉燕揚， 王喻義， 羅 鋒， 曹 丹

(1.四川大學華西醫院肺癌中心， 成都 610041; 2.四川大學華西醫院腹部腫瘤科， 成都 610041)

沉默Versican基因對鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6體外增殖及遷移影響的研究*

李之曦1， 王 力1， 劉燕揚1， 王喻義1， 羅 鋒1， 曹 丹2△

(1.四川大學華西醫院肺癌中心， 成都 610041; 2.四川大學華西醫院腹部腫瘤科， 成都 610041)

目的： 檢測Versican基因在鼠源性肝癌細胞的表達情況，觀察沉默Versican基因對肝癌細胞增殖及遷移能力的影響。 方法： 采用Western blot技術檢測鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6中Versican的表達。構建沉默Versican基因的shRNA質粒(shVCAN)穩定轉染Hepa1-6，通過熒光顯微鏡觀察shVCAN質粒轉染效率，采用RT-PCR及Western blot技術檢測Versican基因的沉默效率。CCK-8法檢測穩定轉染shVCAN質粒后Hepa1-6的增殖能力變化；劃痕及Transwell實驗檢測穩定轉染shVCAN質粒后Hepa1-6的遷移能力變化；免疫熒光及Western blot檢測穩定轉染shVCAN質粒后Hepa1-6上皮細胞-間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關蛋白的表達情況。 結果： 鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6中Versican蛋白呈陽性表達。熒光顯微鏡顯示shVCAN質粒穩定轉染Hepa1-6效率高；RT-PCR及Western blot顯示，shVCAN質粒穩定轉染Hepa1-6后，其內的Versican表達受到明顯抑制。此外，shVCAN質粒穩定轉染Hepa1-6后，其增殖及遷移能力降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時，免疫熒光及Western blot顯示，shVCAN質粒穩定轉染的Hepa1-6內，EMT相關蛋白E-cadherin的表達上調，N-cadherin的表達下調。結論： 沉默鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6內Versican基因的表達，其增殖及遷移能力均受到抑制，其部分機理可能與沉默Versican基因引發Hepa1-6內E-cadherin上調及N-cadherin下調有關。

肝癌； Versican； 增殖； 遷移； 上皮細胞-間質細胞轉化

原發性肝癌(primary hepatic cancer，PHC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發性肝癌的90%左右[1]。在我國的癌癥患者中，肝癌位居死亡原因第二位，是預后最差的腫瘤之一。肝癌預后兇險，治療效果不理想，平均生存期僅4～5個月[2]。由于肝癌的早期癥狀多不明顯，且極易發生血道轉移，故大部分肝癌患者就診時已屬中晚期，失去了手術治療的最佳時機，其5年生存率只有7%，絕大多數患者死于肝癌的局部復發或侵襲轉移[3]。因此，抑制或者延緩肝癌的侵襲轉移成為治療的首要目的，更加有效的，新的治療策略需要基于對肝癌的侵襲轉移機制的深入理解，而尋找出有效的干預靶點則是提高肝癌患者總體療效的關鍵所在。

Versican是細胞外基質中的一種大分子的硫酸軟骨素蛋白多糖，是機體重要的多功能分子，在許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、大腸癌等組織中呈表達上調[4]。研究證實[5]，腫瘤細胞自身會分泌大量的Versican，通過TLR2(toll-like receptor 2)激活巨噬細胞、內皮細胞和成纖維細胞，上調炎性因子的表達，從而營造并維持腫瘤炎性微環境。此外，Versican還參與了惡性腫瘤的轉移過程，我們的既往研究發現[6]，沉默Versican能明顯抑制黑色素瘤的遷移能力。由此看來，Versican在炎癥的發生發展及腫瘤的轉移過程中扮演著至關重要的角色。若能在腫瘤原位沉默或敲除Versican基因的表達，則有希望減少或延緩腫瘤微環境相關炎癥性改變，同時拮抗或逆轉腫瘤的浸潤及轉移能力，最終抑制腫瘤進展。

肝癌的發生發展離不開肝臟微環境的變化[7]。有研究報道，炎癥可以促進肝癌的發生及發展[8-9]，這提示Versican可能涉及了肝癌的發生發展過程，然而其是否能調節肝癌微環境炎性改變，是否參與調控肝癌轉移，目前尚無相關文獻報道。本研究旨在初步探討Versican基因在鼠源性肝癌細胞中的表達情況，設計并構建沉默Versican基因的shRNA質粒(shVCAN)穩定轉染肝癌細胞，觀察shVCAN質粒的轉染效率及在肝癌細胞中的對Versican基因的沉默效率，同時驗證轉染后的肝癌細胞生物學行為的改變情況及部分可能的相關機理，以期為后續的肝癌炎性微環境研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒 質粒shVCAN(pcDNA6.2-GW/EmGFP-MIR-VCAN)及質粒shC(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negative)均購自Invitrogen公司，寡聚單鏈DNA序列見表1，質粒圖譜見圖1。

表1 miRNA 寡聚單鏈DNA序列(附陰性對照序列)

1.1.2 細胞株 小鼠肝癌細胞株Hepa1-6購自中國科學院上海細胞生物研究所，由本實驗室保種。

1.1.3 主要試劑 培養基DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，杜爾伯科改良伊格爾培養基)購自Gibco公司，殺稻瘟菌素Blasticidin S HCl購自Invitrogen公司，轉染試劑LipofecTAMine2000購自Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8購自Dojindo公司，Versican多克隆抗體購自Abcam公司，Anti-β actin antibody購自武漢博士德生物工程公司，E-cadherin及N-cadherin均購自Santa Cruz公司。

圖1 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR圖譜

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 Hepa1-6用含10 %胎牛血清的DMEM培養液，放入37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞瞬時轉染 細胞瞬時轉染操作參照Invitrigen公司的脂質體轉染試劑LipofecTAMine2000使用說明書進行。取鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6(2×105/孔)接種于6孔板中，待細胞貼壁后，按一定比例分別加入LipofecTAMine2000及Invitrigen公司提供的4對miRNA 寡聚單鏈DNA，放入37℃，5%CO2培養箱中培養4～6h后吸除轉染液，并加入DMEM完全培養基于37℃，5%CO2培養箱中繼續培養24h。

1.2.3 細胞穩定轉染 取鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6(2×105/孔)接種于6孔板中，待細胞貼壁后，按一定比例分別加入LipofecTAMine2000及篩選出的沉默效率最高的1對miRNA 寡聚單鏈DNA所構建的相應質粒，放入37℃，5%CO2培養箱中培養4～6h后吸除轉染液，并加入DMEM完全培養基于37℃，5%CO2培養箱中繼續培養48h。通過殺稻瘟菌素Blasticidin S HCl(3.5μg/mL)進行篩選，通過熒光顯微鏡觀察，待有GFP+綠色熒光單克隆細胞團形成時，反復多次挑取陽性克隆，用含Blasticidin S HCl(3.5μg/mL)的選擇性DMEM完全培養基進行擴大培養。

1.2.4 RT-PCR 取各處理組的Hepa1-6細胞，分別提取總RNA，采用兩步法進行RT-PCR反應，RT的反應條件為：94℃ 5min，94℃ 30s，60～61℃(退火溫度隨引物而不同)30s，72℃ 30s，36個循環，72℃ 5min。反應產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(GelDoc型，Bio-RAD公司)成像。GAPDH引物：上游5’-ACCACAGTCCATGCCA-3’下游5’-TCCACCACCCTGTTGC-3’。

1.2.5 Western blot 細胞中加入適量RAPI：PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)(100 ∶1)裂解，離心提取總蛋白，按照BCA(bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯)法測定總蛋白濃度，上樣量為每孔30μg總蛋白。在所提取的蛋白中加入上樣緩沖液，98℃變性10 min。100V恒壓電泳，電泳后進行濕式電轉。轉膜后用5%牛奶封閉液封閉1h，一抗的Versican，E-cadherin、N-cadherin用0.05%TBST緩沖液按1 ∶1000稀釋，4℃孵育過夜，0.05%TBST洗3次，每次15～20min。加入二抗稀釋液(1 ∶1000)，室溫孵育1h，0.05%TBST洗3次，每次15～20min。使用ECL化學發光法檢測，試驗重復3次。

1.2.6 細胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法檢測細胞增殖 取生長良好的細胞懸液，計數并將細胞濃度調整到1×103/孔，接種于96孔板。每天每種細胞各取出3個孔，加入培養基與CCK-8以10 ∶1混合的培養液110μL，同時在僅含培養液的孔加入CCK-8作為空白對照，繼續培養4h，重復該步驟3～5天。用Micro-ELISA儀讀取吸光值，計算出存活細胞百分數，繪制細胞生長曲線。

1.2.7 劃痕及Transwell實驗檢測細胞遷移能力 劃痕實驗：在6孔板中加入約(1～2)×105個細胞，培養至各組細胞形成細胞單層后用槍尖頭沿培養板底部呈“一”字形劃痕。用無血清培養液洗細胞3次，加入完全培養基，培養24h后取樣，拍照。Transwell實驗：用無血清DMEM培養液按1 ∶2.5稀釋Matrigel膠，包被Transwell小室底部，將其放入24孔培養板中，置于細胞培養箱，待膠凝。消化收集細胞，用無血清DMEM培養基懸浮并計數。在小室外加入1mL按1 ∶1混合的條件培養液和DMEM完全培養基，在小室內加入400μL細胞懸液，細胞數為1×104。培養24～48h后，取出Transwell小室，PBS輕輕沖洗，用棉簽將膠及微孔膜上層的細胞輕輕擦掉，950mL/L酒精固定10～15min，蘇木素染色10～15min。用PBS洗凈后顯微鏡下觀察計數細胞。

1.2.8 免疫熒光實驗 取生長狀態良好的細胞接種于覆有蓋玻片的6孔板，制備細胞爬片。PBS清洗爬片，4%的多聚甲醛固定爬片15min；5%BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)室溫孵育細胞30 min。滴加免疫熒光一抗，濕盒內4℃孵育過夜；次日二抗室溫避光孵育1h，DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)復染細胞核；最后抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡玻片觀察采集圖像并拍照記錄。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 穩定沉默Versican基因的鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6的構建

通過RT-PCR技術從Invitrigen公司提供的4對miRNA 寡聚單鏈DNA序列中篩選出沉默效率最高的1對序列(MIR-VCAN-4F及MIR-VCAN-4R序列信息詳見表1)，根據此序列，我們構建了沉默Versican基因的質粒shVCAN及空載體對照質粒shC。待shVCAN及shC質粒穩定轉染Hepa1-6后，首先，通過熒光顯微鏡觀察質粒轉染效率(圖2a)，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)陽性細胞占90%以上。

圖2 成功構建沉默Versican基因的鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6

(a)熒光顯微鏡觀察穩定轉染效率

(b)RT-PCR驗證穩定轉染shVCAN及shC后Hepa1-6中 Versican表達

(c)Western blot驗證穩定轉染shVCAN及shC后Hepa1-6中 Versican表達

接下來，采用RT-PCR及Western blot技術分別在RNA水平及蛋白水平驗證Hepa1-6內Versican基因的沉默效率，結果顯示：Versican基因無論在RNA水平還是蛋白水平上，其表達在Hepa1-6/shVCAN中都明顯低于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6(圖2b-c)。此外，穩定轉染的Hepa1-6，在連續傳代及凍存復蘇后，仍具有強的GFP熒光表達且通過RT-PCR及Western blot證實Hepa1-6/shVCAN中Versican仍處于明顯低表達狀態。以上結果提示，Versican在鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6內呈現陽性表達，同時，我們已成功構建了穩定轉染shVCAN的Hepa1-6。

2.2 CCK-8法檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的增殖

本研究采用CCK-8法檢測Hepa1-6/shVCAN、Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6增殖活性的變化。結果顯示，以正常Hepa1-6作為對照，在72h時，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC活細胞數量減少(P<0.05)；其余觀察點(24,48,96h)Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC，其增殖率的下降無統計學差異(圖3)。該實驗結果表明：沉默Versican對Hepa1-6在72h時的增殖有一定的抑制作用。

圖3 CCK-8檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的增殖變化shVCAN vs. shC, *P<0.05

2.3 劃痕實驗檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的遷移

本實驗采用劃痕實驗檢測Hepa1-6在穩定沉默Versican后其遷移能力的變化，結果顯示，在24h及48h時，以正常Hepa1-6作為對照，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC的遷移細胞數量明顯減少(P<0.01)(圖4)。該實驗結果表明：沉默Versican可抑制Hepa1-6的遷移能力。

2.4 Transwell實驗檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的遷移

采用Transwell實驗檢測Hepa1-6/shVCAN、Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6的遷移能力變化。結果顯示：以穿過Transwell小室的正常Hepa1-6數量作為對照，48h時， Hepa1-6/shVCAN數量較Hepa1-6/shC明顯減少(P<0.01)(圖5)。該實驗結果表明：沉默Versican能有效地抑制Hepa1-6的遷移能力。

圖4 劃痕實驗檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的遷移能力shVCAN vs. shC, *P<0.05, **P<0.01

圖5 Transwell實驗檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6的遷移能力。shVCAN vs. shC, **P<0.01

2.5 免疫熒光及Western-blot檢測穩定沉默Versican后Hepa1-6內EMT(epithelial-mesenchymal transition，上皮間質轉化)通路相關蛋白的變化

我們通過免疫熒光檢測穩定沉默Versican對Hepa1-6中EMT相關特征性蛋白E-cadherin及N-cadherin表達的改變。結果顯示，相對于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6而言，Hepa1-6/shVCAN中E-cadherin的表達水平上調，而N-cadherin的表達水平下調(圖6a)。通過Western blot檢測，我們同樣發現，與Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6相比，在Hepa1-6/shVCAN中，E-cadherin的表達上調，而N-cadherin的表達下調(圖6b)。結果提示，沉默Versican基因后Hepa1-6遷移能力的改變可能與Hepa1-6中EMT通路相關蛋白發生的改變關系密切。

圖6 免疫熒光技術及Western blot驗證穩定沉默Versican后Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達的改變

(a)免疫熒光檢測Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達

(b)Western blot檢測Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達

3 討 論

肝癌是一種高度惡性腫瘤，發病隱匿，容易早期局部擴散及遠處轉移，其預后兇險，死亡率高，患者總生存期短[10]。與其他腫瘤一樣，針對肝癌的傳統治療方法具有特異性差，愈后差和容易復發等缺點，絕大多數患者死于肝癌的局部復發或侵襲轉移。肝癌的發生、發展和轉移均涉及極其復雜的多基因調控異常過程，因此，研究肝癌的病因及侵襲轉移機制具有十分重要的理論和現實意義。

Versican是一種具有多個炎癥配體結合位點的大分子硫酸軟骨素蛋白多糖，存在于大多數軟組織細胞外基質中。通常，它處于低表達狀態，但當組織發生炎癥時急劇上升。在人類中，Versican由位于5q14.3染色體的單基因編碼，人與鼠存在86%的一致性，表明該蛋白多糖的高度保守性。近年來，不斷有研究發現，Versican在許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、大腸癌等腫瘤組織中表達上調，且與惡性腫瘤的轉移密切相關。

由于肝癌是一種與炎癥密切相關的惡性腫瘤，炎癥可以促進肝癌的發生和發展，那么我們推測，Versican可能在肝癌的發生發展過程中扮演重要角色。為了驗證此假設，我們構建了沉默Versican的shRNA質粒(shVCAN)，并將其穩定轉染到小鼠肝癌細胞Hepa1-6中。Hepa1-6是來源于C57L/J小鼠的BW7756肝癌細胞株，表達AFP，免疫原性弱但惡性度較高，病理特征類似臨床肝細胞癌組織，同時也是目前C57BL/6背景下唯一的肝癌細胞株。通過GFP熒光觀察，我們證實了shVCAN及shC質粒的轉染效率高，進一步通過RT-PCR及Western blot證實了Versican在Hepa1-6/shVCAN中的表達明顯低于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6。接下來，我們對轉染前后Hepa1-6的生物學行為進行了檢測，結果發現，在72h時，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6活細胞數量減少，說明沉默Versican能抑制Hepa1-6的增殖，然而其增殖抑制是否與Versican介導的凋亡誘導、細胞周期抑制及細胞自噬有關[11-13]，仍需進一步探索；此外，我們的研究結果顯示，沉默Versican后，Hepa1-6的遷移能力明顯受阻。既往多項研究也曾得到相似的結果。例如有研究發現， 沉默Versican可以干擾CD44-EGFR/ErbB2通路從而減弱黑色素瘤細胞的遷移能力[14]。

如前所述，我們已然發現沉默Versican能抑制鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6的增殖及遷移能力，而遷移能力的改變與惡性腫瘤的轉移過程密切相關。惡性腫瘤的轉移涉及到腫瘤細胞表型的改變以及對周圍環境的改變，是多步驟、多階段的過程。目前已經發現，EMT在生物的發育、組織修復和腫瘤轉移中發揮著重要作用，是腫瘤發展和腫瘤轉移過程的重要標志性轉變。既往研究表明，腫瘤細胞在發生轉移的過程中，會伴隨著腫瘤細胞EMT[15-16]。這一過程包括E-鈣粘蛋白介導的細胞-細胞間的粘附喪失和細胞外基質降解，使得上皮腫瘤細胞失去了細胞極性，從而獲得了較高的侵襲與遷移能力。EMT的發生是以E-cadherin、細胞角蛋白等上皮性標志物表達下調，N-cadherin、Vimentin等間葉性標志物表達上調為特點，而且發生EMT的腫瘤細胞細胞間遷移和侵襲能力增強[17-18]。有文獻報道[19]，Versican在EMT胞外基質重構過程中起到重要的作用。如上所述，我們的研究發現在沉默Versican基因后，鼠源性肝癌細胞株Hepa1-6的遷移能力是受到明顯抑制。那么我們猜測，上述實驗現象的部分機理可能與沉默Versican基因后Hepa1-6中EMT通路相關蛋白發生了改變有關。為了證實穩定沉默Versican可能對Hepa1-6的EMT過程中胞外基質的重構產生影響，我們采用免疫熒光技術及Western blot在細胞水平探討穩定沉默Versican對EMT相關特征性蛋白E-cadherin及N-cadherin表達的改變，結果發現，與Hepa-6/shC及正常Hepa1-6相比，沉默Versican上調了E-cadherin的表達，下調了N-cadherin的表達，提示沉默Versican后Hepa1-6遷移能力的改變可能與Hepa1-6的EMT通路相關蛋白發生了改變有關。

目前，Versican與肝癌的關系，以及其對肝癌細胞的增殖、遷移及部分機理的研究尚未見報道。Versican可作為肝癌發生、進展、遷移和侵襲等過程中一個重要的檢測指標及潛在靶點，其在肝癌發生發展中的機制和意義還有待進一步深入研究，同時也為我們后續進一步研究Versican與肝癌炎性微環境的改變關系提供了一定的參考依據。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現的不端行為承擔相應責任。

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(CNKI)科技期刊學術不端文獻檢測系統學術不端檢測；

同行評議：經同行專家雙盲外審，達到刊發要求。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A, et al. Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1):11-30.

[2] Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications [J]. N Engl J Med, 1971, 285(21): 1182-1186.

[3] Holleb AI, Folkman J. Tumor angiogenesis [J]. CA Cancer J Clin, 1972, 22(4): 226-229.

[4] Wu YJ, La Pierre DP, Wu J, et al. The interaction of Versican with its binding partners [J]. Cell Research, 2005, 15(7): 483-494.

[5] Aspberg A, Adam S, Kostka G, et al. Fibulin-1 is a ligand for the C-type lectin domains of aggrecan and Versican [J]. J Biol Chem， 1999, 274(29): 20444-20449.

[6] Wang Z, Li ZX, Wang YY, et al. Versican silencing improves the antitumor efficacy of endostatin by alleviating its induced inflammatory and immunosuppressive changes in the tumor microenvironment [J]. Oncol Rep， 2015, 6(33):2981-2991.

[7] Inokawa Y, Inaoka K, Sonohara F, et al. Molecular alteration in the carcinogenesis and progression of hepatocellular carcinoma: Tumor factors and background liver factors [J]. Oncol Lett， 2016, 12(5):3662-3668.

[8] Lu K, Liu G, Yang L, et al. Sustainable inflammation transforms hepatic cells by causing oxidative stress injury and potential epithelial-mesenchymal transition [J]. Int J Oncol. 2016, 49(3):971-980.

[9] Matter MS, Marquardt JU, Andersen JB, et al. Oncogenic driver genes and the inflammatory microenvironment dictate liver tumor phenotype [J]. Hepatology， 2016, 63(6):1888-1899.

[10]Navarro AN, Kondo E, Kawamoto H, et al. Isolation and propagation of a human CD133(-) colon tumor-derived cell line with tumorigenic and angiogenic properties [J]. Cell Transplant， 2010, 19(6):865-877.

[11]Feng LX, Sun P, Mi T, et al. Agglutinin isolated from Arisema heterophyllum blume induces apoptosis and autophagy in A549 cells through inhibiting PI3K/Akt pathway and inducing ER stress [J]. Chin J Nat Med， 2016, 14(11):856-864.

[12]方勝濤， 林采余， 張全波，等.海芋粗提物對人肝癌細胞的細胞毒和凋亡誘導作用 [J]。腫瘤預防與治療，2011，24(2)：69-73。

[13]Zhu Y, Wei W, Ye T, et al. Small molecule TH-39 potentially targets Hec1/Nek2 interaction and exhibits antitumor efficacy in K562 cells via G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis indcution [J]. Cell Physiol Biochem， 2016, 40(1-2):297-308.

[14]Hernandez D, Miquel SL, Docampo MJ, et al. V3 versican isoform alters the behavior of human melanoma cells by interfering with CD44/ErbB-dependent signaling [J]. J Biol Chem， 2011, 286(2):1475-1485.

[15]Yan S, Holderness BM, Li Z, et al. Epithelial-mesenchymal expression phenotype of primary melanoma and matched metastases and relationship with overall survival [J]. Anticancer Res， 2016, 36(12):6449-6456.

[16]Feng M, Feng J, Chen W, et al. Lipocalin2 suppresses metastasis of colorectal cancer by attenuating nf-kb-dependent activation of snail and epithelial mesenchymal transition [J]. Mol Cancer， 2016, 15(1):77.

[17]Wang YJ, Liu JZ, Lv P, et al. Long non-coding RNA CCAT2 promotes gastric cancer proliferation and invasion by regulating the E-cadherin and LATS2 [J]. Am J Cancer Res， 2016, 6(11):2651-2660.

[18]Chen H, Chen Q, Luo Q. Expression of netrin-1 by hypoxia contributes to the invasion and migration of prostate carcinoma cells by regulating YAP activity [J]. Exp Cell Res， 2016, 349(2):302-309.

[19]Gao D, Vahdat LT, Wong S, et al. Microenvironmental regulation of epithelial-mesenchymal transitions in cancer [J]. Cancer Res， 2012, 72(19):4883-4889.

Silencing Versican Influences Proliferation and Migration of Mouse Original Hepatocellular Carcinoma Cells Hepa1-6 in Vitro*

Li Zhixi, Wang Li, Liu Yanyang, et al

(LungCancerCenter,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective: To detect the expression of Versican and study the impacts of silencing Versican on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods: The expression of Versican in mouse original hepatocellular carcinoma cells Hepa1-6 was detected by Western blot. Constructing plasmid silencing Versican stably transfected Hepa1-6 cells. The transfected effect of the plasmid in Hepa1-6 cells was observed under fluorescence microscope. The silenced effects of Versican in Hepa1-6 cells were detected by RT-PCR and Western blot. The CCK-8 assay was used to detect the proliferative ability of Hepa1-6/shVCAN. Migration ability of Hepa1-6/shVCAN was examined by Scratch and Transwell assays. The expression of EMT-related proteins was detected by immunofluorescence and Western blot. Results: The expression of Versican in Hepa1-6 cells was positive. The transfected effect of the shVCAN plasmid in Hepa1-6 cells was high under fluorescence microscope.The expression of Versican in Hepa1-6 cells was obviously inhibited after transfected shVCAN plasmid shown by RT-PCR and Western blot analysis. Moreover, the abilities of proliferation and migration of Hepa1-6 cells were also significantly suppressed after transfected shVCAN plasmid compared with those of Hepa1-6/shC and Hepa1-6 cells (P<0.05). The immunofluorescence and Western blot analysis revealed that the expression level of E-cadherin was up-regulated while N-cadherin was down-regulated in Hepa1-6/shVCAN cells compared with those in Hepa1-6/shC and Hepa1-6 cells. Conclusion: Silencing the expression of Versican could inhibit the proliferative and migration abilities of mouse original hepatocellular carcinoma cells Hepal-6 and the partly mechanisms may be related to the up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin.

Primary Hepatic Cancer; Versican; Proliferation; Migration; Epithelial-mesenchymal Transition

2016- 10- 25

2017- 01- 11

*國家自然科學基金(編號：81071864)

李之曦(1985-)，男，四川成都人，博士，講師，主要研究方向：腫瘤生物治療的基礎與臨床研究。

△曹 丹，副教授，E-mail：caodan316@163.com

R735.7；R730.231

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.01.004

?應用基礎研究?