熊果酸對Hacat細胞增殖及凋亡的影響?

王俊慧，李 敏，闞 杰，劉瓦利

(1. 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院皮膚科，北京 100053；2. 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院分子生物實驗室， 北京 100053)

白花蛇舌草是常用中草藥之一，近年來關于該藥物的臨床研究逐漸增多，其中以炎癥、感染性疾病和腫瘤的治療研究最為集中，其抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用受到廣泛關注[1]。

在皮膚疾病的治療中，主要集中于痤瘡、脂溢性皮炎、銀屑病治療方面。多項臨床研究提示，該藥物是用于治療銀屑病血熱證組方中的主藥之一[2-3]。

熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于自然界植物中，特別是在白花蛇舌草等中藥里含量豐富。近年來研究表明，熊果酸具有廣譜的抗腫瘤活性，且能調節(jié)多種細胞信號傳導通路，還可影響腫瘤細胞周期的分布，誘導細胞凋亡[4]。

銀屑病是以角質形成細胞良性增生為特點的一種免疫相關性疾病，其發(fā)病和信號傳導通路異常，與細胞凋亡與增生紊亂、血管生成等多方面因素相關。本課題組旨在通過本研究來探索熊果酸對正常人角質形成細胞Hacat增殖及凋亡的影響，研究其對銀屑病的干預機理，并進一步確定白花蛇舌草治療銀屑病的作用，同時明確熊果酸是否為銀屑病治療的主要單體成分。

1 材料與方法

1.1 試劑

Hacat 細胞株(由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院皮膚科饋贈)，RPMI 1640培養(yǎng)基粉劑(GIBCO 美國 921596)，凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司，南京 KGA107)，凱基新型細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(凱基生物有限公司，南京),熊果酸(中國食品藥品檢定研究院，北京 110742-200518)以二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)助溶，并以含DMSO的終質量分數(shù)為1%培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hacat細胞作為對照。

1.2 器材

酶標儀(BIOTEK 美國)、醫(yī)用低速離心機(白洋，安新縣)、熒光倒置顯微鏡(Nicon，日本)、超凈工作臺(SANYON，日本)、細胞培養(yǎng)箱(SANYON，日本)、流式細胞儀(BD Fas calibur美國)、-20 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、DU640型紫外線分光光度計(BACKMAN 德國、高速冷凍離心機(BACKMAN 德國)。

1.3 使用WST-8法檢測熊果酸對Hcat細胞增殖影響

將Hacat細胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至80%以上融合，傳代分至96孔板中，每孔添加10% RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，并調整細胞濃度為1×104/孔，添加不同濃度熊果酸(根據(jù)相關文獻報道和預實驗結果分為3個熊果酸干預濃度： 0.1 mmol/L，0.05 mmol/L及0.025 mmol/L)進行干預。以1%DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hacat細胞為對照，其干預時間為12 h和24 h。每孔加入新型細胞增殖及細胞毒性檢測溶液10 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀在450 nm處檢測每孔的吸光度。

1.4 使用流式細胞儀檢測熊果酸對Hacat細胞周期及凋亡的影響

將Hacat細胞培養(yǎng)于6孔板中，無血清4 h以同步細胞周期；細胞貼壁約70%時添加干預藥物(添加濃度同前)，干預時間為12 h；收集細胞用冰乙醇固定(細胞周期檢測使用，凋亡不需要固定，可用不含EDTA胰酶消化后收集)。凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒或者凱基細胞周期試劑盒孵育，上機檢測細胞周期，用Cell pro軟件系統(tǒng)進行分析。

1.5 觀察熊果酸對Hacat細胞凋亡的形態(tài)學改變

Hacat細胞培養(yǎng)于6孔板中，細胞貼壁約70%時，添加藥物干預24 h后用PBS洗細胞2次，并在500 μL Binding Buffer中加入5 μL 的錨定蛋白(Annexin V, AV)和5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻。將上述液體滴加至6孔板中，使6孔板均勻覆蓋，避光并在室溫環(huán)境下反應5 min。然后將培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下，使用雙色濾光片(FITC及羅丹明)進行觀察，其中PI熒光信號呈紅色，Annexin V熒光信號呈綠色。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，細胞增殖實驗結果以OD值體現(xiàn)，將OD值轉換為細胞存活率進行數(shù)據(jù)比較；細胞周期則按照各期所占比率進行計算；基于流式細胞儀檢測細胞凋亡，使用細胞凋亡率進行計算，3次重復實驗結果采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度熊果酸對Hacat細胞增殖影響

表1顯示，實驗結果表明，不同濃度的熊果酸在對Hacat細胞進行干預12 h后，即可對其增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用(P<0.01)，各干預組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨著熊果酸濃度的升高，其對應的OD值及細胞生存率均下降。由此可見，熊果酸對Hacat細胞的干預作用與其藥物濃度存在明顯的相關性，且藥物濃度越高對Hacat細胞的抑制作用也越明顯。

表1 熊果酸對Hacat細胞增殖的影響

注：與對照組比較：▲P<0.01

2.2 不同濃度熊果酸對Hacat細胞細胞周期的影響

表2圖1、2顯示，小、中濃度(0.025 mmol/L、0.05 mmol/L)熊果酸對Hacat細胞的細胞周期具有明顯的阻滯作用，可將細胞阻滯于G1/G0期(P≤0.01)；且其抑制作用呈現(xiàn)出一定濃度的依賴性，中、小劑量干預下的G1/G0期及S期細胞分布比較差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.01)。另外值得注意的是，中濃度熊果酸干預后其中2例樣本出現(xiàn)二聚體峰(即凋亡峰)，推測可能是因為凋亡細胞主要為G1/G0期，所以S期細胞相對增多，因與其他標本差異明顯故未納入統(tǒng)計分析。使用高濃度熊果酸進行干預后，Hacat細胞出現(xiàn)大量死亡或凋亡，細胞周期紊亂故也未進行統(tǒng)計分析。

表2 熊果酸對Hacat細胞周期分布的影響

注：為與對照組比較：▲P≤0.01

圖1 不同濃度熊果酸干預Hacat細胞周期分布圖 注：①②③④依次為對照組、低濃度熊果酸組、中濃度熊果酸組和高濃度熊果酸組

圖2 中濃度熊果酸干預Hacat細胞凋亡峰注：G1/G0期前淺色峰為凋亡峰，S期細胞分布較多，考慮為細胞在G1期凋亡所致

2.3 不同濃度熊果酸對Hacat細胞凋亡影響

2.3.1 使用流式細胞儀檢測不同濃度熊果酸對Hacat細胞凋亡的影響 表3圖3顯示，在本實驗中分別統(tǒng)計熊果酸干預后不同時期Hacat細胞凋亡率的改變，結果提示不同濃度的熊果酸都可以促進Hacat細胞的凋亡。其中，小劑量組與對照組晚期凋亡比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中劑量組與對照組早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高濃度熊果酸組與對照組早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時Hacat細胞凋亡率與熊果酸濃度呈線性相關(P<0.01)。

2.3.2 使用免疫熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 圖4顯示，使用Annexin V-FITC試劑盒對凋亡細胞進行了形態(tài)學觀察，結果與流式細胞儀結果基本保持一致，不同濃度熊果酸均可誘導Hacat細胞凋亡。由于免疫熒光顯微鏡下視野有限，故未做統(tǒng)計分析。

圖3 不同濃度熊果酸干預Hacat細胞后凋亡象限圖注：子圖XC是熊果酸對照組，子圖XX是熊果酸小濃度組，子圖XZ是熊果酸中濃度組，子圖XD是熊果酸高濃度組。左上象限(UL)為細胞碎片或死亡細胞，右上象限(UR)為中晚期凋亡或死亡細胞，左下象限(LL)為存活細胞，右下象限(LR)為早期凋亡細胞

圖4 免疫熒光顯微鏡示熊果酸干預后Hacat細胞凋亡情況注：圖像放大倍數(shù)為10×20，①②③分別為小、中、高濃度熊果酸干預12 h后，Hacat細胞的熒光顯微圖像。其中，早期凋亡細胞PS外翻而被Annexin V-FITC 所結合，故呈強綠色；壞死細胞因細胞膜完整性喪失而被 PI 所染色，故呈強紅色或強紅+強綠色；而正常細胞既無PS外翻也未喪失細胞膜完整性，故不被 Annexin V -FITC和 PI 著色

組別例數(shù)早期凋亡率晚期調網(wǎng)率總調網(wǎng)率加DMSO對照組61 423±0 5033 833±0 7655 2570±1 2680 025mmol/L熊果酸62 127±0 7806 963±1 085◇9 0900±0 5370 05mmol/L熊果酸612 963±1 415△14 323±1 293△27 2870±2 697△0 1mmol/L熊果酸627 970±6 283△59 513±2 071△87 4833±4 907△

注：與對照組比較：△P<0.01，◇P<0.05

3 討論

隨著中藥化學現(xiàn)代化技術的進步，中藥單體研究日益成為熱點。目前常用的200多味中藥都進行了系統(tǒng)性研究，并對單味中藥所提取的有效單體進行了臨床試驗。已發(fā)現(xiàn)500多種活性單體，其中幾十種臨床療效確切，如青蒿素治療瘧疾、雷公藤皂甙治療免疫性疾病、黃連素治療腸道感染等[5]。

對有效中藥單體的研究和開發(fā)，能在一定程度促進臨床療效提高，推動中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。然而中藥單體作為單一有效成分，其藥效并不能代表單味中藥，更不能代表組方的藥效。因此，目前有不少學者質疑中藥單體是否屬于中藥范疇。筆者認為，中藥單體研究至少在技術層面是一種進步，能更加清楚地探究中藥的內(nèi)部結構和組分；隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，當信息量足夠大時，便可打通微觀與宏觀，更加完善對中藥屬性的整體把握。另外，中藥單體亦可獨自開發(fā)為成品藥物應用于臨床。

本文研究結果表明，熊果酸作為白花蛇舌草的主要單體之一，能對體外培養(yǎng)的人永生化角質形成細胞Hacat細胞增殖進行有效抑制，且藥物濃度與抑制作用存在明顯相關性。中、小濃度的熊果酸可以將Hacat細胞阻滯于G1/G0期，并對Hacat細胞RNA、 cAMP，cGMP的合成造成直接影響。本研究對于細胞周期的影響研究結果，與其他肝癌細胞和前列腺癌細胞的研究結果具有一致性。此外，熊果酸能誘導Hacat細胞凋亡， 其濃度與Hacat細胞的凋亡率呈正比。由此可見，熊果酸對于維持角質形成細胞增殖及凋亡的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了關鍵性作用。

目前，關于熊果酸研究最困惑的是其生物利用度的問題。體外研究已證實，該單體能夠有效抑制多種腫瘤細胞的增殖，進入體內(nèi)環(huán)境后其生物利用度低，尚不能開發(fā)為成品藥物。如何提高該藥物的生物利用度，值得進一步深入研究。

此外，銀屑病不僅存在角質形成細胞的高速增殖與分化，還存在著異常的細胞凋亡[6]，該病的發(fā)生發(fā)展是多種基因、多種細胞、多條信號傳導網(wǎng)絡共同作用的結果。本研究對熊果酸干預Hacat細胞增殖與凋亡的初步研究，其關鍵療效機制仍需進一步的深入研究與探索。

[1] 紀寶玉,范崇慶,裴莉昕,等.白花蛇舌草的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志, 2014,20(19):235-240.

[2] 曹蕭蕭,徐榮,李福倫,等.銀屑病的中醫(yī)治療[J].醫(yī)學綜述,2015,25(1):117-118.

[3] 齊志峰,楊志波,唐雪勇.從中醫(yī)體質學說論述銀屑病的發(fā)病原因及治療[J].江西中醫(yī)藥,2012,43(9):8-9.

[4] 孫澄玥,戚榮鑫,張茜,等.熊果酸在腫瘤治療中的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016, 16(22):4393-4397.

[5] 陳秀梅,高顏華.淺談中藥現(xiàn)代化研究的進展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2011,9(24):128-129.

[6] 李紅文,丁一,雍磊.銀屑病患者皮損中細胞衰老、增殖和凋亡檢測[J].中華皮膚科雜志，2002,32(1):213-215.