腦源性神經營養因子對左旋多巴誘發的帕金森病異動癥大鼠行為的影響及其作用機制

甄體麗，趙君焱，舒海洋，黃譯腺，包仕堯，劉春風，羅蔚鋒

·論著·

腦源性神經營養因子對左旋多巴誘發的帕金森病異動癥大鼠行為的影響及其作用機制

甄體麗，趙君焱，舒海洋，黃譯腺，包仕堯，劉春風，羅蔚鋒

目的 探討腦源性神經營養因子(BDNF)對左旋多巴(L-DOPA)誘發異動癥大鼠行為的影響及其作用機制。方法 建立單側毀損帕金森病(PD)大鼠模型，隨機分為L-DOPA組、L-DOPA+BDNF組、BDNF組及生理鹽水組。L-DOPA組及L-DOPA+BDNF組腹腔注射L-DOPA 25 mg/kg+芐絲肼6.25 mg/kg，BDNF組及生理鹽水組腹腔注射等體積的生理鹽水，2次/d，連續注射21 d。L-DOPA+BDNF組及BDNF組大鼠右側紋狀體立體定位注射BDNF(1 μg/4 μl)，L-DOPA組及生理鹽水組大鼠右側紋狀體立體定位注射生理鹽水(4 μl)。L-DOPA組和L-DOPA+BDNF組大鼠在紋狀體注射后繼續腹腔注射L-DOPA 7 d。在第2、11、21、23和29 d進行進行異常不自主運動(AIM)評分及跨步實驗。應用Western blot技術檢測大鼠腦紋狀體組織TrkB 磷酸化水平。結果 生理鹽水組及BDNF組大鼠未出現不自主運動。L-DOPA組和L-DOPA+BDNF組第2、11、21 d的AIM評分差異無統計學意義。與L-DOPA組比較，L-DOPA+BDNF組大鼠第23 d的肢體、軸性、口舌AIM評分及29 d的軸性、口舌AIM評分均顯著降低(均P<0.05)。生理鹽水組和BDNF組大鼠各時間點注射前后左前肢跨步數無改變。與注射前比較，L-DOPA組及L-DOPA+BDNF組大鼠各時間點注射后左前肢跨步數均顯著增加(均P<0.05)。4組大鼠的左前肢跨步數在治療過程中均呈下降趨勢。與L-DOPA組和生理鹽水組相比，L-DOPA+BDNF組和BDNF組的毀損側紋狀體pTrkB蛋白表達水平增加(均P<0.05)。BDNF組和L-DOPA+BDNF組兩組之間及L-DOPA組和生理鹽水組兩組間的pTrkB蛋白表達水平差異無統計學意義。各組間健全側紋狀體的pTrkB蛋白表達水平差異無統計學意義。4組間TrkB水平差異無統計學意義。結論 外源給予BDNF能夠改善L-DOPA誘導的異常不自主運動，并且不影響L-DOPA抗PD的運動療效，其機制可能與激活BDNF-TrkB信號通路有關。

帕金森病；異動癥；腦源性神經營養因子

左旋多巴(L-DOPA)替代治療是改善帕金森病(PD)臨床癥狀最有效的方法，異動癥是PD中晚期L-DOPA替代治療的常見運動并發癥之一。N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑——金剛烷胺是目前臨床上最常用于治療輕度異動癥的藥物，但對中-重度異動癥的療效往往不盡人意。服用金剛烷胺所造成的口干、便秘等不良反應發生率較高，給其長期應用帶來了一定的限制。于是，尋找新型有效緩解異動癥的藥物是該領域的研究熱點之一。腦源性神經營養因子(BDNF)廣泛分布在各腦區，調控神經系統的神經營養發育等，與神經系統疾病有密切關聯。研究[1]發現，在PD動物模型中，BDNF蛋白以及其mRNA的表達水平均是下降的，BDNF的特異性受體——酪氨酸激酶受體B(TrkB)表達降低，并且給予BDNF治療之后可以減少神經毒素導致的黑質多巴胺能神經元的丟失[2]。具有met/met等位基因的PD患者腦內釋放的BDNF較少，患異動癥的風險增加[3]。由此可見，BDNF在PD發展過程中及L-DOPA誘導的異動癥的發生發展中均有著重要的作用。本實驗目的在于評價紋狀體內注射BDNF對于L-DOPA誘導的異動癥的作用影響，并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取體質量180～220 g的健康雄性SD大鼠60只，由蘇州大學動物實驗中心提供。

1.1.2 常用藥品及試劑 6-羥基多巴胺(6-OHDA)、L-DOPA、芐絲肼(Sigma公司，美國)，BDNF(R&D 公司，美國)，阿撲嗎啡(TOCRIS公司，英國)，小鼠抗大鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體(深圳碧云天公司)，兔抗大鼠P-TrkB抗體、兔抗大鼠TrkB抗體(Cell Signaling Technology，美國)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及用藥方法 參考鄭偉新等[4]實驗方法，采用6-OHDA毀損右內側前腦束制備偏側大鼠PD模型。2周后，對大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)誘導旋轉行為，向毀損對側旋轉圈數≥210圈/30 min為制模成功。本實驗成功建模40只PD大鼠，隨機分為L-DOPA組、L-DOPA+BDNF組、BDNF組及生理鹽水組，每組10只。L-DOPA組及L-DOPA+BDNF組腹腔注射L-DOPA 25 mg/kg+芐絲肼6.25 mg/kg，BDNF組及生理鹽水組腹腔注射等體積的生理鹽水，2次/d，連續注射21 d。在第22 d，L-DOPA+BDNF組及BDNF組大鼠右側紋狀體立體定位注射BDNF(1 μg/4 μl，1次)，L-DOPA組及生理鹽水組大鼠右側紋狀體立體定位注射生理鹽水(1 μg/4 μl，1次)。L-DOPA組和L-DOPA+BDNF組大鼠在紋狀體注射后繼續腹腔注射L-DOPA 7 d。

1.2.2 行為學測試方法 在第2、11、21、23和29 d對大鼠進行行為學測試。行為學測定包括：(1)異常不自主運動(AIM)評分：每只大鼠在注射后每隔20 min進行1次AIM評分，每次評分觀察時間為1 min，共進行9次。內容包括：①軸性不自主運動：軀體和頭頸不自主向毀損對側扭轉；②肢體不自主運動：毀損對側前肢不自主地拍打；③口舌不自主運動：口舌不自主地向毀損對側舔食。根據嚴重程度分為：①0分：無異常不自主運動；②1分：偶爾有異常不自主運動；③2分：異常不自主運動經常出現；④3分：持續的異常不自主運動，但給予刺激后異常不自主運動停止；⑤4分：持續的異常不自主運動，給予刺激后也不能停止。(2)跨步實驗：于注射前及注射后30 min對大鼠進行跨步實驗，以評價其左前肢功能。實驗者左手固定大鼠后肢及后半身，右手固定右前肢并使左前肢著地，沿大鼠左前肢方向水平迅速移動大鼠，5 s內移動90 cm。重復實驗5次的平均值為該大鼠左前肢跨步數。

1.2.3 大鼠紋狀體組織TrkB表達的檢測 每組取5只大鼠，于行為學測試結束后麻醉，斷頭取腦，并在冰上操作分離取出雙側紋狀體組織，置于組織裂解液中并超聲混勻，4℃ 12 000 r/min(半徑為65 mm)，離心30 min。棄沉淀，用BCA法測定蛋白濃度，取上清按3∶l加上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使蛋白變性。根據所測蛋白濃度調整蛋白上樣量后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉l h，加入兔抗大鼠P-TrkB/TrkB(1∶500)或鼠抗β-actin(1∶5000)抗體，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次/10 min，分別加入相應二抗(山羊抗兔1∶1000，山羊抗鼠1∶2000)抗體在室溫環境下孵育1 h。洗膜3次/10 min后，采用ECL化學發光法顯影檢測pTrkB/TrkB蛋白水平。

2 結 果

2.1 各組間AIM評分的比較 見表1。生理鹽水組及BDNF組大鼠未出現不自主運動。L-DOPA組和L-DOPA+BDNF組第2、11、21 d的AIM評分差異無統計學意義(均P>0.05)。與L-DOPA組比較，L-DOPA+BDNF組大鼠第23 d的肢體、軸性、口舌AIM評分及29 d的軸性、口舌AIM評分均顯著降低(均P<0.05)。

2.2 各組間跨步實驗結果的比較 見表2。與注射L-DOPA前比較，L-DOPA組及L-DOPA+BDNF組大鼠各時間點注射L-DOPA后左前肢跨步數均顯著增加(均P<0.05)。生理鹽水組和BDNF組大鼠各時間點注射前后左前肢跨步數無改變。各組大鼠的左前肢跨步數在整個實驗過程中均呈下降趨勢，與第2 d的左前肢跨步數相比，各組大鼠第29 d的跨步數均明顯減少(均P<0.05)。

2.3 各組間紋狀體組織TrkB蛋白磷酸化水平的比較 見表3。與L-DOPA組和生理鹽水組相比，L-DOPA+BDNF組毀損側紋狀體pTrkB蛋白表達水平增加(P<0.05)；與生理鹽水組和L-DOPA組對比，BDNF組毀損側紋狀體pTrkB蛋白的表達水平增加(P<0.05)；BDNF組和L-DOPA+BDNF組兩組之間毀損側紋狀體pTrkB蛋白表達水平差異無統計學意義；L-DOPA組和生理鹽水組兩組間毀損側紋狀體pTrkB蛋白表達水平差異無統計學意義。各組健全側紋狀體的毀損側紋狀體pTrkB蛋白表達水平差異無統計學意義。各組TrkB水平差異無統計學意義。

表1 各組間AIM評分的比較(x±s,分)組別例數時間點第2d第11d第21d第23d第29dL-DOPA組10 軸性不自主運動8.54±2.8015.28±6.3816.50±5.5318.11±4.3816.60±5.29 肢體不自主運動9.36±2.9014.28±4.2618.80±4.4118.42±4.2719.30±4.36 口舌不自主運動6.18±2.6212.42±5.6017.60±4.2917.48±4.0517.01±2.54L-DOPA+BDNF組10 軸性不自主運動8.33±3.9215.37±4.0915.91±3.7511.33±2.62*12.11±2.06* 肢體不自主運動9.25±3.2913.86±3.5217.58±4.7313.50±2.21*18.55±4.76 口舌不自主運動5.16±2.7612.33±4.2416.50±6.0213.60±1.80*13.08±2.20* 注:與L-DOPA組比較*P<0.01

表2 各組大鼠左前肢跨步數的比較(x±s,步)組別例數第2d第11d第21d第23d第29dL-DOPA組10 注射前8.05±0.637.43±0.756.48±0.566.64±0.786.50±0.48# 注射后10.50±0.75*9.01±0.68*9.05±0.55*8.25±0.77*8.69±0.76*L-DOPA+BDNF組10 注射前8.00±0.657.25±0.577.22±0.557.05±0.357.05±0.38# 注射后9.75±0.67*9.30±0.68*9.20±0.45*8.98±0.32*8.20±0.35*BDNF組10 注射前8.86±1.357.00±0.937.16±0.687.00±0.976.8±0.48# 注射后9.16±1.337.26±0.357.02±0.886.90±0.857.14±0.79生理鹽水組10 注射前8.02±0.926.40±0.887.05±0.776.94±0.386.74±0.25# 注射后7.59±0.896.70±0.796.80±0.596.70±0.556.80±0.61 注:與注射前比較*P<0.05;與第2d比較#P<0.05

表3 各組間紋狀體組織TrkB蛋白磷酸化水平的比較(x±s)組別例數pTrkB的相對表達水平健全側損毀側TrkB的相對表達水平健全側損毀側L-DOPA組51.11±0.121.14±0.151.08±0.651.11±0.68L-DOPA+BDNF組51.05±0.362.16±0.28*△1.01±0.951.03±1.01BDNF組51.08±0.262.62±0.63*△1.09±1.071.08±1.56生理鹽水組51.91±0.121.21±0.491.05±0.881.13±1.38 注:與L-DOPA組比較*P<0.05;與生理鹽水組比較△P<0.05

3 討 論

神經營養因子家族包括神經生長因子、神經營養因子3、神經營養因子4/5和神經營養因子6等，BDNF是神經營養因子家族中的一員。自從BDNF被發現以來，BDNF神經功能一直是熱點研究問題，包括胚胎時期的神經再生、神經環路以及突觸的發生和生長[5-7]；成人時期BDNF的神經維持功能，對突觸可塑性的調控功能的研究[8-10]。BDNF有促進神經再生、改善突觸可塑性作用，其在Alzheimer’s病、孤獨癥等神經疾病治療中皆有重要作用。同時BDNF對于運動障礙疾病PD和亨廷頓病也具有保護作用，可以減少毒性作用引起的黑質神經元丟失[11]。

有研究[2]發現，PD 動物模型中，BDNF的蛋白以及mRNA的表達水平均是下降的，給予BDNF治療之后可以減少神經毒素導致的黑質多巴胺能神經元的丟失。且有報道[3]稱，具有met/met等位基因的PD患者腦內釋放的BDNF較少，患異動癥的風險增加。由此可見，BDNF在PD發展過程中及L-DOPA誘導的異動癥的發生發展中均有著重要作用。本研究主要觀察BDNF對L-DOPA誘導的異動癥的作用。異動癥的主要表現形式為AIM，本研究通過對AIM評分來評判異動癥的嚴重程度。本研究顯示，L-DOPA組和L-DOPA+BDNF組第2、11、21 d的AIM評分差異無統計學意義。與L-DOPA組比較，L-DOPA+BDNF組大鼠第23 d的肢體、軸性、口舌AIM評分及29 d的軸性、口舌AIM評分均顯著降低(均P<0.05)，提示BDNF能緩解異常不自主運動的行為，并且在軸性、口舌、肢體不同方面均有改善異動癥行為作用。

本研究采用跨步數檢測評價異動癥大鼠的前肢運動功能，與注射前比較，L-DOPA組及L-DOPA+BDNF組大鼠各時間點注射后左前肢跨步數均顯著增加(均P<0.05)。提示L-DOPA可以改善左前肢的運動功能。相關動物實驗[11]顯示，BDNF能夠保護神經毒性引起的黑質多巴胺能神經元的減少。但本研究發現，各組大鼠的左前肢的跨步數均隨著治療時間的延長呈減少趨勢。說明大鼠的運動遲緩功能在加重，考慮多巴胺能神經元損毀較重，BDNF的注射位置在紋狀體，且治療時間在6-OHDA毒性發生5周后，故BDNF沒有發揮其神經毒性對抗作用。

神經元的內質網內合成BDNF前體(pro-BDNF)，在相關酶的作用下發生折疊后被分泌到細胞外，pro-BDNF被剪切成為BDNF后發揮其神經營養因子的作用。TrkB是BDNF的特異性高親和力功能受體。BDNF結合到TrkB受體胞外區，誘導TrkB受體二聚化激活膜內區的酪氨酸激酶而自我磷酸化，進而激活下游的信號通路，通過PI3K/Akt、Ras/MEK/MAPK等信號通路促進神經元生長、調控神經發育等[12]。本研究發現，L-DOPA+BDNF組和BDNF組大鼠毀損側紋狀體注射BDNF后pTrkB水平增加，提示外源性給予紋狀體BDNF活化了BDNF-TrkB 信號通路，可能進一步激活了其下游信號通路并參與調控緩解L-DOPA誘導的異動行為。突觸可塑性的改變在L-DOPA誘導的異動癥的發生發展過程中有著重要作用[13]，BDNF-TrkB 信號通路激活下游相關蛋白及信號通路可以調控突觸可塑性[14]。但BDNF緩解L-DOPA誘導的異動癥的具體機制仍需進一步探索。

綜上所述，紋狀體注射外源性BDNF 能夠改善L-DOPA誘導的異動行為，并且不影響L-DOPA抗PD的運動療效，這一作用可能與其激活BDNF-TrkB 信號通路并調控下游信號通路有關。這一實驗結果說明BDNF/TrkB信號通路在異動癥的發生發展中扮演著相關角色，BDNF及其神經營養家族在治療運動障礙性疾病及其并發癥的治療中可能起到某些作用，需要進一步的探索研究。

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Effects of brain-derived neurotrophic factor on the behavior of rats with L-DOPA induced dyskinesia and its mechanism

ZHENTi-li,ZHAOJun-yan,SHUHai-yang,etal.

DepartmentofNeurology，SecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215000，China

Objective To observe brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on the behavior of rats with L-DOPA induced dyskinesia and investigating its mechanism.Methods Hemi-parkinsonian rat models were established by stereotaxically injection of 6-hydroxy dopamine(6-OHDA) in the right medial forebrain bundle. The Parkinson’s disease model rats were randomly divided into four groups: L-DOPA group ,L-DOPA+BDNF group, BDNF group and normal saline group. L-DOPA group and L-DOPA + BDNF group were injected with L-DOPA 25 mg / kg + benserazide 6.25 mg / kg, BDNF group and saline group were injected the same volume of saline. All rats received intraperitoneal injections twice daily and continued for 21 days. At 2,11,21,23 and 29 days, abnormal involuntary movement (AIM) score and stepped experiment were detected. The TrkB protein phosphorylation levels of rat striatum tissue were detected by western blot.Results There was no involuntary movement in normal saline group and BDNF group. There was no statistical significance of the differences of AIM scores between L-DOPA group and L-DOPA+BDNF group at 2 d,11 d,21 d. Compared with L-DOPA group, the body, axial and tongue AIM scores at 23 d and the axial, tongue AIM scores at 29 d were significantly decreased in rats of L-DOPA+BDNF group (allP<0.05). There was no change of left forelimb step number in normal saline group and BDNF group after injection. Compared with before injection, the left forelimb step numbers of L-DOPA group and L-DOPA+ BDNF group were significantly increased at each time point after injection (allP<0.05). The left forelimb step numbers of 4 groups showed a downtrend in the treatment. Compared with L-DOPA group and normal saline group, the pTrkB protein levels in damaged striatum tissues were increased in L-DOPA+BDNF group and BDNF group (allP<0.05). There was no significant difference of pTrkB protein levels in damaged striatum tissues between BDNF group and L-DOPA+ BDNF group and also between L-DOPA group and normal saline group. There was no significant difference of pTrkB protein levels in sound striatum among the 4 groups . There was no significant difference of TrkB protein levels among the 4 groups. Conclusion Exogenous administration of BDNF can alleviate abnormal involtmtary movements induced by L-DOPA without disturbing the efficacy of L-DOPA, which may be associated with activation of BDNF-TrkB signaling pathways.

Parkinson’s disease；L-DOPA induced dyskinesia；brain-derived neurotrophic factor

國家自然科學基金(81200970)

215000蘇州大學附屬第二醫院神經內科

羅蔚鋒

R742.5

A

1004-1648(2017)01-0045-05

2016-03-22

2016-08-14)