木薯抗草甘膦突變株系離體篩選

陸榮生++韓美麗++楊迪++覃建林++馬躍峰

摘要：以木薯（Manihot esculenta Crantz）品種桂熱-6、桂熱-4試管苗葉片為材料，研究草甘膦對愈傷組織增殖與分化的影響，以建立抗草甘膦的木薯離體篩選體系。結果表明，桂熱-6、桂熱-4幼葉愈傷組織誘導與增殖的適宜配方分別為改良B5+2，4-D 0.50～0.75 mg/L、改良B5+2，4-D 0.75 mg/L；愈傷組織分化不定芽的適宜配方分別為改良B5+TDZ 0.75 mg/L、改良B5+TDZ 0.75～1.00 mg/L。愈傷組織增殖過程中，桂熱-6、桂熱-4愈傷死亡率達到50%左右所需的草甘膦濃度分別為800、600 mg/L；愈傷組織分化過程中，桂熱-6、桂熱-4愈傷組織死亡率達到50%左右所需的草甘膦濃度分別為600、400 mg/L。在含草甘膦的愈傷組織增殖培養基、愈傷組織分化培養上分二步篩選獲得了桂熱-6木薯抗草甘膦無性系。溫室幼苗噴施草甘膦試驗表明，抗性無性系幼苗對草甘膦的抗性得到增強，研究結果可為木薯無性系變異育種研究提供參考。

關健詞：木薯（Manihot esculenta Crantz）；愈傷組織；草甘膦；抗性

中圖分類號：S533；Q943.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0160-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.041

Screening for Resistant Glyphosate Somaclonal Variation of Cassava to Glyphosate in Vitro

LU Rong-shenga，HAN Mei-lia，YANG Dia，QIAN Jian-linb，MA Yue-fengb

（a.Microbiology Research Institute；b.Institute of Plant Protection， Guangxi Academy of Agriculture Sciences， Nanning 530007，Guangxi，China）

Abstract：For screening resistant somaclonal variation of cassava to Glyphosate in vitro， the study was made to clarify the effects of glyphosate on proliferation and differentiation of callus from plantlet young leaves in cassava（Manihot esculenta Crantz）species Gui Re-6 and Gui Re-4. The optimum induction and proliferation medium of callus were modified B5 medium supplemented with 0.50～0.75 mg/L 2，4-D for leaves strips from Gui Re-6 and 0.75 mg/L 2，4-D for leaves strips from Gui Re-4. The optimum callus differentiation medium were modified B5 medium supplemented with 0.75 mg/L TDZ for callus from Gui Re-6 and 0.75～1.00 mg/L TDZ for callus from Gui Re-4. To achieve 50% callus browning rate during callus proliferation， the concentration of glyphosate in medium should be 800 mg/L for Gui Re-6，and 600 mg/L for Gui Re-4. To get 50% callus browning rate during callus differentiation， the concentration of glyphosate in medium should be 600 mg/L for Gui Re-6，and 400 mg/L for Gui Re-4. The resistance test by spray of glyphosate showed that the resistant seedlings possessed stronger resistance to glyphosate than the control. Gui Re-6 resistance somaclonal variation to glyphosate was screened by two step method in callus proliferation medium and cultivation of callus differentiation. By this experiment，the screening system of resistance somaclonal variation to glyphosate was established in vitro in cassava， and this methods can be used for clone breeding studies.

Key words：cassava（Manihot esculenta Crantz）；callus；glyphosate；resistant

木薯（Manihot esculenta Crantz）是集能源、飼料、食用為一體、在華南地區大量種植的經濟作物，草害是影響木薯產量的主要因素之一[1]。生產上常采用人工除草與化學除草二種方式解決雜草為害問題，這二種方式不僅勞動力成本高、農藥殘留影響環境，而且效果一般；不同木薯種植地區及不同生長時期雜草群落不同，且經常處于動態變化，需要針對不同地區與雜草群落推出專一性較強的除草劑，因此除草劑開發成本較高。廣譜性除草劑草甘膦雖然可以防除大部分雜草，但使用中對木薯也有一定傷害[2]。選育抗草甘膦木薯品種是解決這一問題的有效途徑之一[3]。

目前，已有關于利用細胞無性系培養過程中存在變異性這一特點，通過在培養基中加入選擇壓力的方法定向篩選抗性品種的應用報道，主要集中在篩選提高植物抗病能力、抗鹽能力、抗草甘膦性等抗逆性變異無性系[4，5]。蘇媛等[6]以5個草莓品種組培苗為試材，以草莓枯萎病菌毒素作為選擇壓力，篩選草莓抗枯萎病突變體，結果表明，篩選的抗病植株對枯萎病菌的抗性高于野生型再生植株。裴懷弟等[7]將3個品種（系）的馬鈴薯試管苗在添加不同濃度NaCl的培養基上直接誘導分化成苗，結果表明，隨著鹽濃度的增加，3個品種（系）再生苗的耐鹽能力提高。葉曉青等[8]等研究不同濃度氯化鈉（NaCl）對百喜草愈傷組織分化和植株再生的影響，得到一批體細胞耐鹽突變體篩選材料。Zhang等[9]以2個品種大蒜蒜瓣基部為外植體，以大蒜白腐病病菌粗毒素為篩選因子，離體培養篩選獲得可抗50%粗毒素的大蒜抗病苗。程智慧等[10]以2個品種蒜瓣基部誘導的愈傷組織為篩選對象，以大蒜葉枯病菌粗毒素為篩選因子，通過離體分步篩選培養獲得可抗30%粗毒素的抗病苗。張恩讓等[11]在含不同濃度百草枯的培養基上采用直接接種和逐級培養法，選擇大蒜抗百草枯愈傷組織細胞系，發現所用品種在低濃度百草枯脅迫下都有一定的抗性。

目前，鮮見關于利用離體變異技術篩選木薯抗草甘膦變異無性系方面的報道。木薯品種桂熱-6、桂熱-4是廣西近年選育的高產抗病新品種，本研究以這兩個品種為對象，探討其愈傷組織誘導與分化條件、測定愈傷組織在增殖與分化期對草甘膦的敏感性，從而以草甘膦為選擇壓力，通過一步篩選法與分步篩選法，建立離體篩選木薯抗草甘膦無性系的方法，為抗木薯抗草甘膦突變體的離體篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯品種為桂熱-4、桂熱-6，采用其組培苗進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同植物生長調節劑組合對木薯葉片愈傷組織誘導、增殖、分化不定芽的影響 取20 d苗齡木薯無菌苗頂部嫩葉，切為2～3 mm寬的條帶，接種于愈傷組織誘導培養基中，暗培養5 d后移入光下培養20 d，調查愈傷組織誘導率；然后將形成的愈傷組織切下移至愈傷增殖培養基上進行培養，培養25 d后調查愈傷增殖率；繼代增殖培養3次后，挑選生長旺盛、質地緊密的愈傷組織繼代于分化培養基上，光下培養25 d，調查不定芽發生率。

愈傷組織誘導、增殖試驗培養基為改良B5基本培養基添加不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）；愈傷分化試驗培養基為改良B5基本培養基添加不同濃度玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）、6芐基腺嘌呤（6-BA）；生根培養基為1/2MS基本培養添加0.25 mg/L吲哚丁酸（IBA）；培養基中蔗糖30 g/L，pH 5.8。培養條件為溫度（26±2） ℃，光照時間14 h/10 h，光照度1 800 lx。

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的葉片數/接種的葉片總數×100%

愈傷組織增殖率=直徑比原接種愈傷組織塊大0.2 cm以上的愈傷組織塊數/接種愈傷塊總數×100%

愈傷組織分化率=產生不定芽的愈傷組織塊數/接種愈傷塊總數×100%

愈傷組織死亡率=死亡褐化的愈傷組織塊/接種愈傷塊總數×100%

1.2.2 愈傷組織增殖與分化階段對草甘膦的耐受性 分別將0、200、400、600、800、1 000、1 200 mg/L的草甘膦加入愈傷組織增殖與分化培養基中，然后將愈傷組織塊接種于培養基上，每處理35個外植體，3次重復，培養條件同“1.2.1”，培養25 d后，調查愈傷組織增殖生長、愈傷組織死亡率、愈傷組織不定芽分化情況。

1.2.3 抗病無性系的篩選 采用二步階段篩選法篩選抗草甘膦無性系及再生植株的抗草甘膦能力鑒定。二步階段篩選法：將桂熱-6、桂熱-4 25 d齡的愈傷組織分別培養于含草甘膦800、600 mg/L的增殖培養基中，篩選培養25 d，然后將存活的愈傷組織分別移入含草甘膦600、400 mg/L的分化培養基中選擇培養25 d，調查抗性不定芽產生數量。所選的抗性不定芽，在進一步擴大繁殖后，切下2～3 cm長的嫩枝，移入生根培養基中，所得抗性植株移入溫室種植。

1.2.4 抗性無性系抗草甘膦能力測定 抗草甘膦植株室內離體抗性測定：將抗草甘膦無性系試管苗與對照試管苗的葉片無菌條件下切下，接種于含草甘膦600 mg/L的分化培養基中培養7 d，觀察葉片變化；抗草甘膦植株溫室抗性測定：選取溫室2個月苗齡的大小一致的抗性植株和對照植株各5植株，噴施濃度為0.5%的草甘膦藥液，施藥7 d后測試其抗性。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑組合對木薯愈傷組織誘導與增殖的影響

將切下的木薯無菌苗幼葉接種于愈傷組織誘導培養基中，培養7～10 d后，觀察到外植體切口出現乳白色愈傷組織，培養25 d時產生愈傷組織的外植體數量達到最大，統計各處理愈傷組織誘導率，然后將愈傷組織塊切下移入到新鮮培養基上，25 d后統計愈傷組織增殖情況，結果見表1。

從表1可以看出，2個木薯品種添加不同濃度2，4-D，愈傷組織誘導率與增殖率總體均高于添加NAA的各處理。添加2，4-D的情況下，2個品種達最大愈傷誘導率與增殖率所需的2，4-D濃度相同。

木薯品種桂熱-6葉片在添加2，4-D的愈傷誘導培養基中培養時，2，4-D濃度為0.50、0.75、1.00 mg/L處理下愈傷誘導率分別達到87.5%、90.4%、88.7%，均顯著高于對照和其他處理，三者之間無顯著差異。所誘導出的愈傷組織在愈傷增殖培養中，2，4-D濃度0.50、0.75 mg/L處理愈傷增殖率較高，分別達73.5%、75.9%，顯著高于對照和其他處理，二者之間無顯著差異。2，4-D為1.00、1.25 mg/L處理雖然愈傷誘導率較高，但繼代后愈傷增殖率下降。

木薯品種桂熱-4葉片在添加2，4-D的愈傷誘導培養基中培養時，2，4-D濃度0.75 mg/L的處理愈傷誘導率為64.4%，顯著高于對照和其他處理。所誘導出的愈傷組織轉入相應培養基繼代后，愈傷增殖率達45.8%，顯著高于對照及2，4-D濃度0.50 mg/L之處的其他處理。

綜上所述，木薯品種桂熱-6葉片愈傷組織誘導、增殖的最適2，4-D濃度為0.50～0.75 mg/L，桂熱-4葉片愈傷組織誘導、增殖的最適2，4-D濃度為0.75 mg/L。

2.2 培養基中不同植物生長調節劑組成對愈傷組織分化出芽的影響

愈傷組織移入分化培養基中，光下培養15 d左右，可觀察到愈傷表面有綠色芽點出現，培養至20～25 d，可以觀察到綠芽大量出現。含ZT與TDZ的分化培養基均有愈傷分化不定芽的現象發生，但愈傷分化率因激素濃度與品種而有所不同，結果見表2。

從表2可以看出，桂熱-6愈傷組織在添加不同濃度ZT的分化培養基中培養時，ZT為0.75、1.00 mg/L時愈傷分化率分別為64.6%、61.7%，顯著高于對照及其他處理，二者之間無顯著差異。桂熱-4愈傷組織在添加不同濃度ZT的分化培養基中培養時，ZT為1.25 mg/L時愈傷分化率為57.7%，顯著高于對照及其他處理。2個品種在ZT 1.25 mg/L時芽均粗短，大多數不能正常發育。

在添加TDZ的培養基中，2個品種愈傷組織不定芽分化率總體高于相應添加ZT的各處理。對于品種桂熱-6，添加TDZ 1.00 mg/L時愈傷分化率達84.5%，顯著高于對照及其他處理。桂熱-4添加TDZ 0.75、1.00、1.25 mg/L時愈傷分化率在45.3%～51.0%之間，顯著高于對照及其他處理，三者之間差異不顯著，TDZ 1.25 mg/L處理所誘導的芽粗短，后期難以正常發育。

綜上所述，品種桂熱-6愈傷分化培養基以添加TDZ 1.00 mg/L為宜，桂熱-4愈傷分化培養基以添加TDZ 0.75～1.00 mg/L為宜。

2.3 草甘膦對木薯愈傷組織增長的影響與抗性選擇壓力的篩選

將愈傷組織接種在添加不同濃度草甘膦的培養基上培養。隨著培養時間的延長，各處理愈傷增殖率呈不同程度下降，大量愈傷組織褐化死亡，所存活的愈傷組織形態上變化不大，但色澤變成深灰色。不同濃度草甘膦對愈傷組織增殖率與死亡率影響不同，結果見圖1、圖2。

從圖1可以看出，在低濃度草甘膦下，2個木薯品種愈傷組織對草甘膦均有一定的抗性，當草甘膦濃度較高時，這種抗性才消失。培養基中草甘膦濃度為200 mg/L時，桂熱-6愈傷組織增殖率有小幅下降，有輕微褐化發生；之后隨著草甘膦濃度的升高，愈傷組織增殖率不斷下降，伴隨著愈傷死亡率不斷上升。當草甘膦濃度為800 mg/L時，愈傷誘組織增殖率降為6.6%，愈傷死亡率達53.2%；草甘膦濃度為1 000 mg/L時，愈傷組織增殖率為0，愈傷組織死亡率較高。

與桂熱-6相比，桂熱-4對草甘膦的加入更為敏感。從圖2可以看出，草甘膦濃度為200 mg/L時，其愈傷組織死亡率達到50.0%，愈傷組織增殖率只有30.86%；草甘膦濃度為600 mg/L時，愈傷死亡率達到57.9%，愈傷組織增殖率只有3.1%；草甘膦濃度為800 mg/L時，其愈傷組織死亡率為100%，愈傷組織增殖率為0。

因此，以愈傷組織死亡率達到50%左右為抗性選擇劑的參考標準，以木薯品種桂熱-6、桂熱-4愈傷組織為對象進行抗草甘膦無性系選擇中，草甘膦做為抗性選擇劑濃度分別為800 mg/L與600 mg/L時較為適宜。

2.4 草甘膦對木薯愈傷組織分化不定芽的影響與抗性選擇壓力的篩選

愈傷組織在添加不同濃度草甘膦的分化培養基上培養25 d時，不同濃度草甘膦對愈傷組織分化率與死亡率影響不同，結果見圖3、圖4。

從圖3可以看出，木薯品種桂熱-6愈傷組織分化率在草甘膦濃度為400 mg/L降為30.4%，降幅較大，愈傷組織死亡率達39.5%；草甘膦濃度為600 mg/L時，愈傷組織分化率僅7.9%，愈傷組織死亡率為58.7%；當草甘膦濃度為800 mg/L時，愈傷組織分化率為0，愈傷組織死亡率為100%。

木薯品種桂熱-4愈傷組織在培養基草甘膦濃度為200 mg/L時，愈傷組織分化率達到28.3%，愈傷組織死亡率只有40.3%；草甘膦濃度為400 mg/L時，愈傷組織死亡率達52.3%，愈傷組織分化率只有4.5%；草甘膦濃度為600 mg/L時，愈傷組織死亡率達96.9%，愈傷組織分化率為0。

因此，以愈傷組織死亡率達到50%左右為抗性選擇劑的參考標準，木薯品種桂熱-6、桂熱-4愈傷組織分化培養階段，草甘膦作為抗性選擇劑量濃度分別為600 mg/L與400 mg/L較為適宜。

2.5 二步階段篩選法篩選抗草甘膦無性系及再生植株

在木薯品種桂熱-6、桂熱-4愈傷增殖培養基中分別加入800、600 mg/L草甘膦，進行抗草甘膦愈傷組織篩選。將2個品種選出的抗性愈傷組織移入愈傷分化培養基中（桂熱-6、桂熱-4愈傷分化培養基中分別加入600、400 mg/L草甘膦），進行抗草甘膦不定芽織篩選，結果見表3。

從表3可以看出，采用二步階段篩選法，桂熱-6獲得了11個抗草甘膦抗性無性系，其中3個可以在含草甘膦的培養基上正常生根；桂熱-4獲得了5個抗草甘膦抗性無性系，但是均不能在含草甘膦的培養基上產生生根。

圖5為薯品種桂熱-6愈傷組織誘導至生根過程，圖6為添加草甘膦的情況下抗性愈傷組織篩選與抗性芽產生過程。

抗草甘膦植株室內離體抗性測定表明，抗性植株葉片在含600 mg/L草甘膦的分化培養基中培養7 d，葉片無藥害癥狀，而對照植株葉片均變黃（圖7）；抗草甘膦植株溫室抗性測定表明，噴草甘膦7 d后，對照植株葉片發黃枯萎，而抗性植株無明顯的藥害癥狀（圖8）。

3 小結與討論

生長調節劑種類與濃度是愈傷組織誘導、增殖、分化成功與否的關鍵因素。2，4-D與NAA二種生長素對木薯愈傷組織誘導與增殖效果比較表明，2，4-D對愈傷組織誘導效果高于NAA，且低濃度2，4-D所誘導產生的愈傷組織主要為緊密型愈傷，易于在繼代后增殖；添加NAA的培養基中所誘導出的愈傷組織多為松散型愈傷，繼代培養后褐化死亡較多，未褐化的愈傷增殖率也很低。研究認為生長素所誘導的愈傷組織類型分為二類：緊密型與松散型，緊密型愈傷新鮮，容易分化出不定芽；松散型愈傷則在繼代中易于死亡，且難于直接分化出不定芽[12，13]，本研究結果也證實了這一現象。

TDZ是一種具有類似腺嘌呤類細胞分裂素活性的新型植物生長調節劑，已應用于植物組織培養[14，15]，但在木薯中鮮見報道。在本試驗中發現，一定濃度TDZ對木薯品種愈傷組織分化的效果均高于ZT，這說明對于木薯這種愈傷組織難于分化產生不定芽的木本植物，采用活性強的細胞分裂素能夠分化產生不定芽，這可能與TDZ對于植物傷口愈合反應與細胞的恢復性生長有一定幫助，可以降低愈傷組織繼代切割產生的褐化物有關[16，17]，由于褐化物減少，愈傷組織能夠正常生長并分化不定芽。

植物材料在長期組織培養過程中存在一定頻率的體細胞無性系變異，利用這一特點，在培養基中添加目標物理或化學物質作為選擇壓力，通過篩選，可獲得抗性無性系。本試驗研究表明，愈傷組織對草甘膦的敏感性與木薯基因型及愈傷組織發育階段有關，所用木薯品種桂熱-6對草甘膦的耐受水平高于品種桂熱-4，同時，2個品種都表現為愈傷組織增殖階段對草甘膦抗性高于愈傷分化階段，其中木薯品種桂熱-6愈傷組織增殖、愈傷分化階段對草甘膦的半致死劑量分別為800、600 mg/L；木薯品種桂熱-4愈傷組織增殖、愈傷分化培養階段，對草甘膦的半致死劑量分別為600、400 mg/L。王延峰等[18]在利用胚性愈傷組織篩選抗除草劑綠磺隆突變體的研究中發現，在高濃度綠磺隆壓力下選出的抗性愈傷組織，在同樣的選擇壓力下不能分化成苗；騫宇[19]發現除草劑Basta對油菜愈傷組織的分化比對愈傷組織的生長具有更強的抑制作用，這與本研究結論相似。

抗性植株的篩選有一步篩選法與分階段篩選法。一步篩選法因為只篩選了一次，沒有考慮到植物組織不同生長階段對選擇壓力的抗性不同，因此效果較差。分階段篩選法對不同生長階段，有針對性地采用不同的選擇壓力，這樣可以有效地得到抗性植株，同時避免了假抗性植株的大量產生。本試驗所獲得的抗性植株在噴施草甘膦后能夠存活，說明本試驗所用的方法對抗性植株篩選是有效的。

綜上所述，通過研究確定了草甘膦對木薯愈傷組織不同發育階段的影響，建立了以草甘膦作為選擇壓力的木薯離體篩選體系，并得到了抗草甘膦的3個無性系，其抗性有待大田試驗進一步驗證。研究結果可為細胞無性系變異培育木薯優良無性系提供依據。

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