豆腐柴愈傷組織誘導及細胞懸浮培養

李智超++李琳玲++程華++程水源

摘要：為探究適宜豆腐柴（Premna microphylla Turcz）細胞懸浮培養條件，以豆腐柴葉片為材料，進行了愈傷組織的誘導、繼代培養、愈傷組織分散、懸浮培養的研究，建立了搖瓶懸浮培養體系。結果表明，豆腐柴葉片誘導得到的愈傷組織形態各異，其中誘導最適合懸浮培養的松散型胚性愈傷組織的培養基為MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂。通過纖維素酶和果膠酶分散愈傷組織塊可以得到較好的分散細胞系，最適合懸浮細胞生長的培養基條件為MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT+3%蔗糖，其懸浮培養細胞鮮重增加量平均每7 d可達6.46倍，暗培養相對更適合細胞的增殖。經最佳培養條件下培養21 d的豆腐柴懸浮細胞中果膠和蛋白質平均含量達6.57%和0.12%，遠低于豆腐柴天然葉片中的含量。

關鍵詞：豆腐柴（Premna microphylla Turcz）；愈傷組織；懸浮細胞

中圖分類號：R282；Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0171-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.043

Embryoid Induction and Cell Suspension Culture of Premna microphylla Turca

LI Zhi-chao1，LI Lin-ling1，2，CHENG Hua1，2，CHENG Shui-yuan1，2

（1. College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei，China；2.Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratory， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： In order to find the suspension culture conditions of Premna microphylla Turca，the leaf blades of the experimented Premna microphylla Turca，induced embryogenic callus and subculture，which established a good dispersion and a high dynamic suspension cell line. The results showed that the callus induction from leaves were different. Which induces the most suitable medium for suspension culture of loose embryogenic callus contained MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L NAA+3% sucrose+0.8% agar. Cell lines can be dispersed better by cellulase and pectinase dispersed callus block. The most suitable medium for suspension cell growth contains MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT+3% sucrose. And in this medium，the fresh weight of the suspension cultured cells could be increased by 6.46 times per 7 days. Dark culture was more suitable for cell proliferation. The average contents of pectin and protein were 6.57% and 0.12% in the suspended cells of Premna microphylla Turca，which had been cultured for 3 weeks under the optimum culture conditions.

Key words： Premna microphylla Turcz； callus； suspension culture

豆腐柴（Premna microphylla Turcz）又名臭黃荊、豆腐木、腐婢等，為馬鞭草科豆腐柴屬落葉直立灌木[1]。其葉片具有豐富的果膠，含量可達39.5%，酯化度73%～78%，可以作為優良的果膠提取原料[2]。此外，豆腐柴葉片中粗蛋白含量高達29.0%～34.1%，在目前已知植物中名列前茅；其根莖部含有木栓酮、木栓醇、十八碳酸、甾醇、胡蘿卜甙、柚皮素、香草酸等多種藥用成分[3，4]，被用于中國傳統中醫治療皮膚傷口、感染、瘧疾、痢疾、頭痛和毒蛇咬傷等[4]。

目前，豆腐柴主要通過野外采集獲得，由于野生條件下豆腐柴零星散布在海拔500～1 500 m向陽山坡疏林下、林緣、溝谷邊、荒山、丘陵、灌木層中[3，4]，難以滿足生產需要。此外，其生長緩慢，種子自然態萌發率低。因此，豆腐柴的繁殖和人工栽培尤為重要。關于這類野生藥食用植物的人工繁育研究進展緩慢。房江育等[5]、李琳玲等[6]、劉世彪等[7]分別對豆腐柴扦插和水培生根進行了相關試驗。程華等[8]、程水源等[9]探討了植物生長調節劑對豆腐柴愈傷組織誘導的影響。而關于豆腐柴細胞懸浮培養體系構建的研究鮮見報道。本研究通過對豆腐柴疏松愈傷組織誘導和細胞懸浮培養進行研究，分析誘導疏松的、適合進行懸浮培養的豆腐柴愈傷組織的最適培養基及豆腐柴細胞懸浮培養的適宜條件，以期為通過細胞大規模培養生產豆腐柴果膠或次級代謝產物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自湖北省羅田縣大別山區野生豆腐柴的新鮮植株。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導 從豆腐柴枝中上部剪取生長健壯、無病、蟲害的嫩葉，用流水沖洗后再用去離子水浸泡沖洗干凈，置于超凈臺上無菌風吹干，用70%乙醇消毒30 s，0.1%升汞消毒數分鐘，無菌水沖洗5～6次，每次1 min，用無菌濾紙吸干材料表面水分。

將消毒處理好的葉片用解剖刀切成0.5～1.0 cm2的小葉盤，接種于MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂。（24±2） ℃下進行14 h 2 000 lx光照+10 h黑暗培養。

1.2.2 懸浮培養分散細胞制備 分別采取機械分散法和消化分離法分散愈傷組織細胞。

機械分散法：將繼代3次的愈傷組織用解剖刀切碎，再用無菌玻璃棒攪拌使其分散，經無菌80目網篩過濾后即為分散培養細胞。

消化分離法：選取生長旺盛，繼代3次的愈傷組織約2.0 g，接種于細胞分散培養基MS液體培養基+0.04 mg/mL纖維素酶+0.04 mg/mL果膠酶中，24 ℃，120 r/min懸浮振蕩培養2 d后，無菌80目網篩過濾即得分散培養細胞。

1.2.3 細胞懸浮體系優化設計 細胞懸浮培養采取以MS+5%蔗糖+350 mg/L水解酪蛋白為基本培養基，加上不同濃度配比的植物生長調節劑（表1）。用150 mL三角瓶懸浮培養豆腐柴愈傷組織細胞，取每瓶50 mL液體培養基進行接種。

將接種液接種于含有不同激素的MS液體培養基中（表1），置于24 ℃、24 h 2 000 lx光照或24 h黑暗條件下，120 r/min懸浮振蕩培養。7 d繼代1次，連續繼代2～3次，將細胞懸浮培養物用80目鎳網過濾，濾液分裝后繼續培養，作為起始懸浮培養液。每隔3 d取3瓶細胞培養液進行離心（5 000 r/min，10 min）后，于60 ℃烘干，測定細胞干重。

1.2.4 細胞形態觀察 用解剖針挑取少量愈傷組織細胞于載玻片上，加一滴醋酸洋紅染色液（細胞核染色用I-KI溶液），用鑷子將組織搗碎，蓋上蓋玻片，輕壓蓋玻片至愈傷組織均勻分散，然后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 懸浮細胞果膠提取及含量測定 用孔徑為100目的鋼絲篩去掉細胞培養液留下懸浮細胞培養物，冷凍干燥后，用研缽粉碎，倒進50 mL燒杯中，再加入0.1 mol/L HCL 20 mL。微熱攪拌30 min后，減壓抽濾。濾液用2倍體積的95%乙醇沉淀，所得沉淀物呈透明、泡沫、膠狀；將濾液裝入分液漏斗進行分離，得到果膠后，使乙醇在空氣中自然揮發，至質量恒定后，稱重。

1.2.6 懸浮細胞蛋白質提取及含量測定 用孔徑為100目的鋼絲篩去掉細胞培養液留下懸浮細胞培養物，利用紫外吸收法測定懸浮細胞蛋白質含量。具體方法：用5 mL去離子水研磨成勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL于試管中。根據蛋白質濃度，用0.1 mol/mL pH 7.0磷酸緩沖液適當稀釋，分別稀釋成10倍、20倍和100倍3種樣品，用紫外分光光度計分別在280 nm和260 nm波長下測定吸光度，以pH7.0磷酸緩沖液為空白調零。

按照以下公式計算：蛋白質濃度=1.45A280 nm-0.74A260 nm（mg/mL）；蛋白質含量=（1.45A280 nm-0.74 A260 nm）n/樣品重×100%，式中，A280 nm為溶液在280 nm處的吸光度；A260 nm為溶液在260 nm處的吸光度；n為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑對豆腐柴懸浮培養細胞生長的影響

外植體經過誘導培養14 d后，在切口處形成白色或淺綠色愈傷組織。經分散后進行細胞懸浮培養，細胞均能達到較好的增殖。但組織細胞顏色和形態各有差異，主要有4種類型（圖1），也有一些過渡類型。

染色后顯微鏡放大觀測，結果（圖2）表明，A類細胞多為橢圓形或接近圓形，形狀規則、體積較小、細胞核較大、內含物豐富（圖2A）；B類細胞高度液泡化，有長條形、半月形、圓形等一些不太規則的形狀。這類細胞體積大、內含物少，細胞核較小，細胞染色淺，多數不著色（圖2B）；C類細胞形狀規則、體積較小、細胞間聯系緊密，壓片時不易分散（圖2C）；D類細胞基本為膨大變形呈長條形細胞或無細胞器的畸變細胞，形狀規則的細胞幾乎沒有（圖2D）。

以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA、KT、2，4-D和NAA，培養基中植物生長調節劑配比組合、培養體系的顏色變化、鏡檢細胞形態變化見表2。經過比較可以看出，添加2，4-D的培養基懸浮培養得到的豆腐柴細胞內含物較多，加NAA的培養基懸浮培養得到得細胞多變形或死亡，分裂成碎片，另外，培養基中加6-BA的效果普遍要比KT好。

2.2 細胞分散程度對懸浮培養的影響

愈傷組織細胞分散方法對細胞懸浮培養體系有一定影響。圖3是通過機械分散法處理愈傷組織后細胞培養產物狀況，培養體系中較渾濁（圖3A），細胞團大小不均一，鏡檢會看到溶液中有較多死細胞，但容易產生較大的細胞團，且細胞團中易分化出胚性體細胞（圖3B）。利用纖維素果膠酶分散細胞后懸浮培養細胞體系，靜置后培養液較清澈，細胞團大小較均一，培養后期亦會出現較大顆粒的胚性細胞。

2.3 光照條件對愈傷組織的誘導、繼代培養和生長狀況的影響

將豆腐柴的葉接種于相同的愈傷組織誘導培養基中，分別置于黑暗和12 h/d、2 000 lx光照條件下進行培養。結果發現，2種培養條件下的外植體產生愈傷組織的時間和誘導愈傷組織的出愈率基本相同，但愈傷組織的狀態有較大差異。光培養的愈傷組織呈翠綠色、質地緊密，繼代后愈傷組織生長緩慢；暗培養條件下愈傷組織呈白色，較易褐變，愈傷組織生長疏松，繼代后生長較快。因此，豆腐柴愈傷組織的誘導和繼代培養宜在暗培養下進行。

由于培養基中所加激素的不同，懸浮細胞培養液狀態和細胞鮮重增加量也不相同（表3）。結果顯示，愈傷組織分散程度越好，越有利于懸浮細胞系的建立，后期細胞增殖越明顯；懸浮培養的最佳培養基是MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT，其懸浮培養細胞鮮重增加量平均每7 d可達6.46倍。

2.4 懸浮細胞果膠和蛋白質含量

將外植體誘導培養14 d后的豆腐柴愈傷組織細胞，經纖維素酶和果膠酶處理后，置于經上述最佳懸浮培養基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中，24 h黑暗條件，120 r/min懸浮振蕩培養21 d后，測定細胞果膠和蛋白質含量。結果（表4）表明，培養細胞中果膠平均含量達6.57%，蛋白質達到0.12%，遠比豆腐柴天然葉片中含量低。

3 小結

結果表明，豆腐柴葉片誘導的疏松型愈傷組織細胞，經過0.04 mg/mL纖維素酶+0.04 mg/mL果膠酶處理后可以得到較好的分散培養細胞，在最佳液體培養基MS+0.4 mg/L 2，4-D+0.8 mg/L KT中， 24 h黑暗條件，120 r/min懸浮振蕩培養，大約7 d后即可得到較好的懸浮細胞系。雖然致密型愈傷組織塊，經酶處理后也可以得到分散細胞，但由于后期培養系中細胞碎片較多，不利于懸浮細胞的增殖。初步測定比較了在最佳懸浮培養條件下，豆腐柴愈傷組織細胞和葉片中果膠和蛋白質含量差異，結果顯示，豆腐柴懸浮培養的細胞中，主要的營養成分果膠和蛋白質遠遠低于葉片組織。后期需要對基本培養基配方、蔗糖濃度、前體物添加等因素進一步優化。

應用細胞懸浮培養技術，促成細胞增殖和細胞內營養成分的合成，進行工廠化生產，可緩解當前豆腐柴資源匱乏的困境；而且大量的研究也表明，相對于組織誘導培養，細胞懸浮培養更容易產生胚性細胞，進而促成植株再生，這也為將來克服豆腐柴自然狀態下胚發育不足，種子難以繁殖等問題奠定前期基礎[10，11]。雖然本研究中細胞增長量及果膠等成分均較低，但后期通過對培養技術體系進行優化，可為豆腐柴細胞工廠化擴大培養及有效成分提取提供理論依據。

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