頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜法結合保留指數法測定龍井茶的香氣成分

胡西洲，彭西甜，周有祥，趙明明，嚴 偉，龔 艷，胡定金

（湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，湖北 武漢 430064）

頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜法結合保留指數法測定龍井茶的香氣成分

胡西洲，彭西甜，周有祥，趙明明，嚴 偉，龔 艷，胡定金

（湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，湖北 武漢 430064）

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）結合保留指數法分析龍井中的揮發性成分。以茶葉香氣成分的種類和數量為參照，考察HS-SPME的最佳萃取條件；同時優化色譜分離條件；利用優化的HS-SPME-GC/MS條件分析龍井茶中的揮發性成分。結果表明，運用HS-SPME-GC/MS能有效測定龍井茶中的揮發性成分，這些揮發性成分中主要含有醇類（31.14%）、酯類（15.66%）、酮類（10.42%）、雜環類化合物（15.00%）等。頂空固相微萃取-氣相色譜質譜法結合保留指數分析是一種快速有效分析龍井茶香氣成分的方法，可提高定性分析的準確性和效率，使定性結果更加可靠。該定性分析方法也為其他復雜樣品中揮發性成分分析提供參考。

頂空固相微萃取；氣相色譜/質譜；保留指數法；龍井茶；香氣成分

0 引 言

茶葉香氣成分是鑒別茶葉品質的重要指標，受到業界的廣泛關注。茶葉香氣是茶鮮葉在制作過程中通過復雜的生化反應而產生的，香氣成分的組成、含量與不同的茶樹品種、栽培環境、加工工藝、茶葉儲存時間、溫度等息息相關。任何一種茶葉的香氣都是由不同物質以不同濃度組合的綜合表現，而呈香物質間的相互作用也會對整體香型有顯著的影響[1]。

據統計，已從各類茶葉中分離出700多種香氣成分，主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、酚類、雜環化合物、含硫化合物、含氮化合物、碳氫化合物等10大類化合物[1-2]。茶葉香氣通常由感官技術來評價，盡管GB/T 23776——2009《茶葉感觀評審方法》已對其作了詳細規定，但評審結果容易受評審人員主觀判斷的影響。隨著現代儀器分析飛速發展，準確分析茶葉代謝物指紋圖譜，結合各種化學計量方法，已成為茶葉香氣組分鑒定和品質預測的重要手段[3-5]。

保留指數（retention index，RI）是由 Kovats于1958年首次提出，該指標反映了化合物與固定相間相互作用，作為一種穩定的色譜定性參數，具有很好的準確度和重現性，可用于化合物的鑒定[6-7]。

龍井茶作為中國十大名茶之一，有著1200多年歷史，按照傳統工藝在地理標志產品保護范圍內加工而成，是一種具有“色綠、香郁、味醇、形美”的扁形綠茶[8]。本研究采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結合保留指數法快速分析龍井茶香氣成分的方法，通過與譜庫檢索進行有效結合，提高了定性分析的準確性和可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890N-5975型氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司）；手持固相微萃取器，配50/30 μm CAR/ DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取頭 （美國Supelco公司）；PC-420D恒溫數顯磁力攪拌器（美國Corning公司）。

1.2 試劑

正構烷烴標準品（C8～C32，美國Supelco公司）；癸酸乙酯（98%，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 試驗材料

龍井茶樣品采自杭州西湖龍井茶核心區。樣品經粉碎后過20目篩，密封保存，待測。

2 方 法

2.1 GC-MS分析條件

GC條件：進樣口溫度為230℃；載氣為高純氦氣（純度99.999%）：柱流量為1.0mL/min；不分流進樣。

程序溫度1：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升溫至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升溫至180℃，保持3 min；再以15℃/min的速率升溫至230℃。

程序溫度2：首先以70℃保持1min；以3℃/min的速率升溫至120℃，保持2min；再以5℃/min的速率升溫至180℃，保持20min。

程序溫度3：首先以40℃保持2min；以2℃/min的速率升溫至185℃；再以5℃/min的速率升溫至210℃，保持40min。

程序溫度4：首先以40℃保持1min；以2.5℃/min的速率升溫至130℃，保持1min；再以8℃/min的速率升溫至250℃，保持1min。

程序溫度5：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升溫至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升溫至180℃，保持3 min；最后15℃/min的速率升溫至230℃，保持5min。

MS條件：電子電離源（EI）；離子化電壓為70eV；離子源溫度為200℃；四級桿溫度為150℃；接口溫度為280℃；質譜掃描范圍為35～450amu。

2.2 SPME操作方法

準確稱取1.0 g經粉碎后茶葉于15 mL的頂空瓶中，加入20 μL 10 mg/L癸酸乙酯標準溶液，再加入10mL沸水，密封，60℃水浴下磁力攪拌萃取，再將已經老化的CAR/DVB/PDMS萃取頭穿透密封墊插入頂空瓶內茶湯上方，固定好SPME手柄，小心推出纖維頭開始萃取并計時，60min后取出，然后插入氣相色譜進樣口，在230℃下熱解吸5min。

2.3 定性與定量分析方法

定性：1）各組分峰與NIST12.L譜庫中標準化合物的匹配度；2）化合物的保留指數；3）查閱香氣成分的相關文獻。定量：利用面積歸一法計算得到各組分的相對含量。

2.4 保留指數的測定

單一線性程序升溫的條件下保留指數計算式為

式中：RI——待測組分的保留指數；

RTunknown——待測組分的保留時間；

RTn、RTn+1——待測組分前后正構烷烴的保留時間；

n——正構烷烴的碳原子數。

3 結 果

3.1 固相微萃取條件的優化

3.1.1 固相萃取涂層的選擇

比較了3種萃取頭對龍井茶中揮發性成分的萃取效果，試驗結果表明，PDMS萃取涂層由于適用于小分子非極性揮發性化合物，萃取效果最差。PDMS/DVB萃取涂層則適用于萃取極性揮發性物質，萃取效果較好。CAR/DVB/PDMS萃取頭結合了以上兩種萃取頭的優點，具有更好的萃取效果，因此選擇萃取頭CAR/DVB/PDMS作為龍井茶香氣成分的萃取材料。

3.1.2 萃取溫度的優化

萃取溫度是影響萃取速度的重要指標，當溫度升高時有利于提高分析物的擴散速率，從而增加萃取速率；而萃取溫度過高會降低分析物的分配系數，因此選取40，50，60，70，80℃進行萃取。結果如圖1所示：隨著萃取溫度增加，峰數和峰面積均逐漸增加，當萃取溫度達到60℃時峰面積達到最大，隨著溫度進一步增加，解吸附速率增加，總峰面積開始降低，選擇60℃作為萃取溫度。

圖1 萃取溫度對峰數和峰面積的影響

3.1.3 萃取時間的優化

萃取時間是指達到或接近平衡所需要的時間，在萃取的初始階段，待分析組分很快富集到固相微萃取的纖維頭上，但是隨著萃取時間的延長，富集速度越來越慢。比較了萃取時間分別為20，30，40，50， 60，70，80min時的萃取效果，結果如圖2所示：隨著萃取時間增加，峰數和峰面積均逐漸增加，當萃取時間達到60min后峰面積變化很小，選擇60min作為萃取時間。

圖2 萃取時間對峰數和峰面積的影響

3.1.4 解吸附條件的優化

萃取完成后將萃取頭置于氣質聯用儀的進樣口分別解吸附1，3，5，7，9min，比較不同解吸附時間下龍井茶揮發性成分的變化情況。結果表明，解吸附時間為5 min時，各揮發性物質的峰面積達到最大，而后增加解吸附時間，峰面積不會增加且峰型變差。選擇5min作為解吸附時間。

3.2 色譜分離條件的優化

選用一根30 m長的DB-5MS毛細管柱對龍井茶揮發性成分進行分離，探討不同的升溫程序對分離效果的影響，同時考慮色譜分離時間的問題，分離時間過長對于色譜定量和分析效率會有一定的負面影響。

按照2.1中溫度程序考察色譜分離效果。通過分析，確定溫度程序5是比較適合的溫度程序，龍井茶揮發性組分分離相對較好，如圖3所示。

3.3 龍井茶揮發性成分的測定

采用頂空固相微萃取模式，對杭州核心區的龍井樣品的香氣成分進行分析，對各色譜峰進行譜庫檢索，并根據混合正構烷烴和色譜峰的保留時間計算各組分的保留指數。根據譜庫檢索結果，結合參考文獻的保留指數值對龍井樣品的香氣成分進行了鑒定，共得到49種化合物，再運用面積歸一化法得到各組分的百分含量，結果見表1。由結果分析可知，龍井樣品的香氣成分十分復雜，且相對含量差異較大，主要包括烯烴類 （5.22%）、醇類 （31.44%）、酯類（15.66%）、醛類 （6.82%）、酮類 （10.42%）、酚類（7.18%）、胺類（3.55%）、烷烴類（4.46%）、芳香烴類（0.55%）和雜環類化合物（15.00%），其中醇類、酯類、雜環類化合物含量占主導地位。

表1 龍井茶香氣成分分析結果1）

圖3 程序升溫5測得龍井茶香氣成分總離子流圖

在已鑒定的香氣組分中排名前5位的分別為：芳樟醇（13.68%）、甲氧基苯基肟（11.14%）、(Z)-3-己烯醇己酸酯（7.19%）、4-氨基-2-甲基苯酚（6.27%）、3,5-辛二烯-2-酮（5.23%）。芳樟醇及其氧化物是所有組分中含量最高，總量達到17.23%。芳樟醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、香葉醇是主要醇類化合物，相對含量分別為13.68%、4.41%、3.89%、3.03%。順-3-己烯醇-己酸酯、順-3-己烯醇-丁酸酯、順-3-己烯醇-乙酸酯為酯類化合物中主要呈香物質，含量分別為7.19%、2.67%和2.37%。順-3-己烯醇-己酸酯具有強烈彌散性梨香。另外，含量較高的有帶有紫羅蘭香氣的β-紫羅酮（1.09%）、茉莉花香型的茉莉酮（2.44%）。此外，如檸檬烯（0.10%）、α-松油醇（0.40%）、α-紫羅酮（0.13%）、己酸-（E）-2-己醇酯（0.20%）含量相對較少，但含量少的物質未必對其香氣的貢獻一定小，任何香氣都是由不同組成和含量的化合物及其相互間作用共同體現[1-3，9]。

4 結束語

本文以西湖核心區域的龍井茶為研究對象，利用HS-SPME和GC/MS結合保留指數法快速準確分析其揮發性香氣成分，分析結果具有較高的準確性和重現性，顯示出較大的優越性。該方法彌補了常規GC-MS譜庫檢索定性或者通過保留指數定性方法的不足，將譜庫檢索與保留指數結合，提高了復雜化合物定性分析的準確性和效率，使定性結果更加可靠。該分析方法也為其他復雜樣品中揮發性成分分析提供參考。由于茶葉香氣組分的組成和含量與茶樹品種、栽培環境、加工工藝、茶葉儲存時間、溫度等密切相關，下一步將利用此分析方法結合統計學手段圍繞不同區域、不同保存條件、時間和摻偽開展茶葉香氣成分的指紋圖譜研究。

[1]施夢南，龔淑英.茶葉香氣研究進展[J].茶葉，2012，38（1）：19-23.

[2]林杰.茶葉香氣的圖譜分析及在茶葉品質真實性鑒定中的應用[D].杭州：浙江大學，2013.

[3]代毅，須海榮.采用SPME-GC/MS聯用技術對龍井茶香氣成分的測定分析[J].茶葉，2008，34（2）：85-88.

[4]申明月，劉玲玲，聶少平，等.頂空-氣相色譜-四極桿質譜結合保留指數法測定普洱茶香氣成分[J].食品科學，2014，35（6）：103-106.

[5]程權，楊方，李捷，等.頂空固相微萃取-全二維氣相色譜/飛行時間質譜法分析閩南烏龍茶中的揮發性成分及其在分類中的應用[J].色譜，2015，33（2）：174-181.

[6]JUN Y，LIU X B，ZHU W W，et al.Retention indices for identification of aroma compounds by GC:Development and application of a retention index database[J]. Chromatographia，2015，78（1）：89-108.

[7]GORGENYI M，DEWULF J，LANGENHOVE H V.Temperature dependence of the Kovats retention index：The entropy index[J].Journal of Chromatography A，2006，1137（1）：84-90.

[8]地理標志產品 龍井茶：GB/T 18650—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[9]GOODNER K L.Practical retention index models of OV-101，DB-1，DB-5，and DB-WAX for flavor and fragrance compounds[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（6）：951-958.

[10]HAMM S，LESELLIER E，BLETON J，et al.Optimization of headspace solid phase microextraction for gas chromatography/mass spectrometry analysis of widely different volatility and polarity terpenoids in olibanum[J]. Journal of Chromatography A，2003，1018（1）：73-83.

[11]LIN J，DAI Y，GUO Y N，et al.Volatile profile analysisand quality prediction oflongjing tea (camellia sinensis)by HS-SPME/GC-MS[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2012，13（12）：972-980.

[12]WANG L F，LEE J Y，CHUNG J O，et al.Discrimination of teas with different degrees of fermentation by SPME-GC analysis of the characteristic volatile flavour compounds[J].Food Chemistry，2008，109（1）：196-206.

[13]Lü H P，ZHONG Q S，LIN Z，et al.Aroma characterisation of Pu-Erh tea using headspace-solid phase microextraction combined with GC/MS and GC-olfactometry[J].Food Chemistry，2012，130（4）：1074-1081.

[14]LEE S，PARK M K，KIM K H，et al.Effect of supercritical carbon dioxide decaffeination on volatile components of green teas[J].Journal of Food Science，2007，72（7）：497-502.

（編輯：莫婕）

Determination of aroma components from Longjing tea by headspace solid phase micro-extraction and GC-MS combined with retention index

HU Xizhou，PENG Xitian，ZHOU Youxiang，ZHAO Mingming，YAN Wei，GONG Yan，HU Dingjin
（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

A headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry（HSSPME-GC/MS）method combined with retention index was used to analyze aroma components from Longjing tea.The optimal extract conditions were evaluated according to the kinds and amounts of aroma compounds from Longjing tea，and the chromatographic separation conditions were also investigated.Under the optimal conditions，aroma components from Longjing tea were identified by mass spectral library searching combined with retention index comparison.The results showed that the HS-SPME-GC/MS method could identify aroma components from Longjing tea effectively，mainly including alcohols(31.14%)，esters(15.66%)，ketones(10.42%)，and heterocyclic compounds(15.00%). This method is a fast，accurate，effective way to obtain aroma components from Longjing tea，which will facilitate qualitative analysis，and provide reference for analysis of volatile components from other complex samples.

HS-SPME；GC-MS；retention index；Longjing tea；aroma components

A

：1674-5124（2017）02-0055-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.011

2016-07-29；

：2016-09-28

公益性行業（農業）科研專項（S201203046）；湖北農業科技創新中心項目（2016-620-000-001-037）

胡西洲（1979-），男，湖北監利縣人，副研究員，博士，主要從事農產品質量安全及風險評估工作。

胡定金（1964-），男，湖北團風縣人，研究員，主要從事農產品質量安全及風險評估研究。