固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

高 慧，邢 燕，汪 洋，宋金枝，王 旭

（1.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東 淄博 255026；2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

高 慧1，邢 燕1，汪 洋1，宋金枝2，王 旭2

（1.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東 淄博 255026；2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

建立一種快速、準(zhǔn)確測定人體尿液中腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺及5-羥色胺4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法。尿液樣品以Waters Oasis WCX固相萃取柱富集，依次用2mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗雜質(zhì)，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）提取被分析物。經(jīng)Agilent C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）分離，以甲醇與乙酸鈉溶液的不同配比設(shè)置流動相梯度，在熒光檢測激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長340nm條件下，測定人體尿液中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果表明：4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的回收率為92.2%～104.8%，相對偏差為1.6%～3.1%，檢出限為0.002～0.05μg/mL。該方法穩(wěn)定、快速、簡便，能滿足人體尿液中多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量測定。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；固相萃取；高效液相色譜；熒光檢測

0 引 言

神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)末梢分泌的化學(xué)物質(zhì)，在化學(xué)突觸傳遞中擔(dān)當(dāng)信使的作用。單胺類物質(zhì)（MNTs）是最早發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）。MNTs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周植物神經(jīng)系統(tǒng)和激素介導(dǎo)的內(nèi)分泌及外分泌活動中起著極其重要的作用[1]。固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統(tǒng)的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更可將分析物與干擾組分有效分離，正成為復(fù)雜樣品純化、富集的有效手段。

人體尿液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的準(zhǔn)確檢測，對嗜鉻細(xì)胞瘤等相關(guān)疾病診斷、新藥研制開發(fā)、藥物療效評價等方面有重要意義。由于人體尿液基質(zhì)非常復(fù)雜，且單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在尿液中的含量較低，因此對檢測方法的靈敏度和選擇性都提出較高的要求。MNTs的檢測方法主要有電化學(xué)分析法[2]、熒光法[3]、高效液相色譜-熒光檢測法[4]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]。電化學(xué)分析法測定生物樣品的穩(wěn)定性較差，且修飾電極的使用壽命有限，靈敏度不高[2]；熒光法易受樣品基質(zhì)影響，穩(wěn)定性也較差[3]；毛細(xì)管電泳法的重現(xiàn)性較差[7]。MNTs本身質(zhì)譜響應(yīng)信號不強，準(zhǔn)確測定存在困難，且色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的儀器比較昂貴[8]。本研究旨在通過固相萃取柱將人體尿液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進行選擇性的萃取富集，采用高效液相色譜熒光檢測法進行分析，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確測定尿中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀-熒光檢測器（美國沃特世公司）；Agilent C18色譜柱（250mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）；微量注射器；固相萃取儀（美國色譜科）；CP 225D微量分析天平（德國賽多利斯）；Oasis HLB、Oasis WCX、Oasis WAX固相萃取柱（美國沃特世公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：重酒石酸去甲腎上腺素（美國 Sigma公司），酒石酸腎上腺素（上海阿拉丁試劑有限公司），多巴胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司），5-羥色胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（HPLC級，美國默克公司）；乙腈（HPLC級，美國默克公司）；鹽酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（分析純，天津化學(xué)試劑有限公司）；乙酸鈉（分析純，上海化學(xué)試劑總廠所屬上海試劑四廠）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

反相液相色譜柱Agilent C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；進樣量為10 μL；熒光檢測激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長340 nm；柱溫為30℃；流動相及梯度洗脫程序如表1所示。流動相成分中緩沖液即為含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA-2Na）的0.04mol/L乙酸鈉溶液（pH 4）。

表1 流動相梯度表

1.2.2 樣品的檢測

1）樣品預(yù)處理

取新鮮人體尿液2mL，加200μL 1mol/L的鹽酸溶液將尿液進行酸化處理，隨后加入2.0mL 0.5mol/L的乙酸銨，混勻，超聲5 min后，以5 000 r/min離心10min。取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液于4℃冰箱保存待用。

2）樣品制備

就業(yè)關(guān)系到國計民生，直接影響社會穩(wěn)定。中國由于經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整，面臨較大的就業(yè)壓力。而旅游業(yè)是一個勞動密集型產(chǎn)業(yè)，在緩解就業(yè)壓力方面起著重要作用。在旅游就業(yè)中，由于旅游非正規(guī)就業(yè)對教育和技能水平的要求不高，因此在吸收城鎮(zhèn)失業(yè)人口和農(nóng)村剩余勞動力方面發(fā)揮著重要的作用，而在旅游非正規(guī)就業(yè)中，存在著一種規(guī)模較大但又經(jīng)常被人們忽視的就業(yè)類型——自我就業(yè)。

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis WCX固相萃取柱。取上述處理過的尿樣4 mL上樣，流量為1 mL/min，依次用2 mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗雜質(zhì)，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）洗脫被分析物，流量為0.5mL/min。所得洗脫液氮吹至近干，用初始流動相復(fù)溶至1.0mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，供HPLC分析。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取EP、NE、DA和5-HT標(biāo)準(zhǔn)品各20mg，分別置于10mL容量瓶中，加入0.01mol/L的鹽酸溶液，充分震蕩使其溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度均為2000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于4℃冰箱中。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取EP、NE、DA和5-HT 4種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.01mol/L的鹽酸溶液稀釋為EP 30.0 μg/mL、NE 50.0 μg/mL、DA 50.0 μg/mL和5-HT 20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.01，0.05，0.30，1.00，2.00mL于10mL容量瓶中，初始流動相定容，用HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 測 定

取1.2.2方法制備的尿液上樣，進行HPLC分析，保留時間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇及優(yōu)化

固相萃取的效果取決于其填料類型[10]，本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Oasis WCX）和弱陰離子交換柱（Oasis WAX）對神經(jīng)遞質(zhì)的萃取效果，結(jié)果見圖1。表明4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在Oasis WCX柱有較好的保留，且回收率最高，雜質(zhì)去除理想；Oasis HLB回收率次之，但干擾雜質(zhì)去除不夠理想；Oasis WAX回收率不理想。Oasis WCX柱為弱陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子。這4種神經(jīng)遞質(zhì)極性比較弱，在中性條件下為不帶電荷的分子，而在酸性條件下成為帶正電荷的弱陽離子。

圖1 不同固相萃取柱對提取回收率的影響

2.1.2 淋洗液的選擇

尿樣成分復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)和鹽類化合物，會干擾目標(biāo)化合物的洗脫，因此洗脫之前的凈化步驟也很重要。本文考察了純水、甲醇、5%氨水-水溶液、20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液4種不同溶劑作為淋洗液的去雜質(zhì)效果，結(jié)果表明，先用2 mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液，再用2mL甲醇作為淋洗液時，能最大程度去除尿液中的尿酸及部分中性和堿性化合物的干擾，且對于4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在萃取柱有最大保留。

2.1.3 洗脫條件的優(yōu)化

圖2 不同洗脫液對提取回收率的影響

考察了2%甲酸-甲醇、2%甲酸-乙腈、含2%甲酸的乙腈-水（85∶15，ν∶ν）3種不同的洗脫溶液，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明用含2%甲酸的乙腈水溶液洗脫效率最高。洗脫液每次1mL進行洗脫，當(dāng)用量為5 mL時，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)已完全洗脫，因此，本實驗采用5mL含2%甲酸的乙腈-水溶液（85∶15，ν∶ν）作為洗脫液。

2.1.4 流量的優(yōu)化

樣品過柱流量也是優(yōu)化目標(biāo)化合物固相萃取效果必須考慮的因素，因本實驗的目標(biāo)樣品為尿樣，基于臨床應(yīng)用考慮和固相萃取柱的容量，樣品體積一般不會大于10mL，而較小的流量一般都會對回收率提高有積極影響，因此本實驗選擇流量為0.5mL/min。

2.2 分離條件的優(yōu)化

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在水溶液中具有較高的溶解性，造成在一般反相色譜柱保留強度較弱[11]。為了提高穩(wěn)定性和達(dá)到更好的分離效果，選擇酸性溶液加入適量的有機相作為流動相。分別考察了乙腈和乙酸鈉水溶液、甲醇和乙酸鈉水溶液，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙酸鈉水溶液分離效果與峰形優(yōu)于乙腈和乙酸鈉水溶液，因此有機相選用了甲醇。為了減少溶液中金屬離子的干擾加入了EDTA-2Na。

流動相的pH是離子對色譜分離的關(guān)鍵，4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在酸性條件下穩(wěn)定性最佳，考察了流動相的pH 2.0～pH 4.0對樣品出峰情況的影響，如圖3所示，結(jié)果表明，在pH較小時峰分離不好，在pH 4.0時色譜分離效果最好，故選用pH 4.0的流動相分析。

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別考察了 Waters XBridge C18柱、Waters Symmetry C18柱和Agilent C18柱分離效果，發(fā)現(xiàn)Waters XBridge C18柱和Waters Symmetry C18柱對于分離EP和NE效果不夠理想。Agilent C18柱對分析物分離效果最好，因此選用此色譜柱。

圖3 流動相pH對分離效果的影響

選用紫外檢測器，發(fā)現(xiàn)峰形過小，靈敏度太低，以致無法檢出[12]。選用電化學(xué)檢測器，發(fā)現(xiàn)其背景較高且基線波動較大，原因可能是其電極在分析過程中參與氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物累積在電極表面使得檢測靈敏度降低，低濃度分析物難以檢出[13]。故改用熒光檢測器，其基線平穩(wěn)，選擇性好，可有效分離分析物。用熒光檢測器進行掃描，發(fā)現(xiàn)4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280，340 nm附近有最大吸收峰，樣品溶液雜質(zhì)干擾小，檢測靈敏度高，故定其為檢測波長。尿液樣品圖譜與樣品加標(biāo)分離效果如圖4所示。

圖4 尿液樣品圖譜與樣品加標(biāo)分離效果圖

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍及方法檢出限

采用外標(biāo)法，配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計算4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢出限，結(jié)果見表2。線性范圍和檢出限可以滿足嗜鉻細(xì)胞瘤等相關(guān)疾病診斷的臨床需求。

表2 EP、NE、DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 方法的精密度和回收率

取健康人的混合尿，分別加入1，30，200 μL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，每一質(zhì)量濃度平行制作5份，連續(xù)5d，按1.2.2方法萃取凈化后，氮吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC分析，每份測定3次，記錄各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)峰面積的平均值，代入當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得濃度，考察方法的日內(nèi)精密度和日間精密度；將測得的各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)色譜峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進樣測得的色譜峰面積對比，得方法的絕對回收率，結(jié)果見表3。日內(nèi)、日間精密度對于嗜鉻細(xì)胞瘤患者用藥前后療效對照具有重要的臨床價值，絕對回收率滿足了4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測要求。

表3 方法的精密度和準(zhǔn)確度（n=5）

3 結(jié)束語

本文通過對尿液樣品前處理條件和色譜分析條件的優(yōu)化，選擇了最佳檢測條件，實現(xiàn)了對尿中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的同時測定，具有操作簡便、靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、雜質(zhì)干擾少及結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點。因尿液基質(zhì)復(fù)雜，尿中4中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量較低，將尿液樣品經(jīng)鹽酸溶液酸化處理后，在4℃冰箱保存一周結(jié)果無顯著變化，對于臨床患者尿液留存有實際意義。本文選用的Oasis WCX固相萃取柱既能實現(xiàn)尿液中復(fù)雜干擾物的去除，又能實現(xiàn)待測物的完全保留和洗脫，實現(xiàn)了HPLC-熒光檢測器對4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的完全分離檢測，滿足了尿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的分析測試要求。

[1]壽天德.神經(jīng)生物學(xué)[J].2版.北京：高等教育出版社，2013：259-266.

[2]劉雪，王蘭，樊陽，等.Ti02-石墨烯-Nafio復(fù)合膜修飾玻碳電極同時測定多巴胺和尿酸[J].化學(xué)通報，2012，75（5）：458-462.

[3]汪叢瑩，龐志功，汪寶琪，等.熒光測定SD大白鼠不同腦區(qū)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[J].分析化學(xué)，1999，27（1）：101-103.

[4]徐鵬，白燕平，楊海松，等.高效液相色譜熒光檢測法同時測定大鼠腦區(qū)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物[J].中國藥學(xué)（英文版），2015，24（7）：458-466.

[5]鄧少東，盧洪梅，林勵，等.庫侖陣列電化學(xué)-高效液相色譜法同時檢測大鼠不同腦區(qū)中的 8種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，33（6）：644-648.

[6]HUBBARD K E，WELLS A，OWENS T S，et al.Determination of dopamine，serotonin，and their metabolites in pediatric cerebrospinal fluid by isocratic high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection[J].Biomed Chromatogr，2010（24）：626-631.

[7]LIU G S，CHEN J N，MA Y F.Simultaneous determination of catecholamines and polyamines in PC-12 cell extracts by micellar electrokinetic capillary chromatography with ultraviolet absorbance detection[J].J Chromatogr B，2004（805）：281-288.

[8]WANG H，CHUNG-DAVIDSON Y W，LI K，et al. Quantification of monoamine neurotransmitters and melatonin in sea lamprey brain tissues by high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Talanta，2012（89）：383-390.

[9]WEN N，ZHAO X E，ZHU S Y，et.al.Determination ofdopamine， serotonin,biosynthesis precursors and metabolites in rat brain microdialysates by ultrasonic-assisted in situ derivatization-dispersive liquid-liquid microextraction coupled with UHPLC-MS/MS[J].Talanta，2016，161（12）：253-264.

[10]勾凌燕，劉景東，王憬，等.固相萃取-高效液相色譜電化學(xué)法檢測大鼠血漿兒茶酚胺[J].分析試驗室，2006，25（1）：90-94.

[11]魏麗麗，陳虹，鐘明，等.高效液相色譜-電化學(xué)法測定大鼠紋狀體細(xì)胞外液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量[J].藥物分析雜志，2011，33（3）：467-470.

[12]張文靜，李杰，張志虎，等.尿中高香草酸和香草扁桃酸的高效液相色譜測定法 [J].環(huán)境與健康雜志，2009，26（3）：248-250.

[13]張璐璐，馮芳，葉小敏，等.高效液相色譜-熒光法測定小鼠腦組織中單胺遞質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2010，41（4）：367-371.

（編輯：莫婕）

Determination of monoamine neurotransmitters in human urine by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-fluorescence detector

GAO Hui1，XING Yan1，WANG Yang1，SONG Jinzhi2，WANG Xu2
（1.Zibo Center For Disease Control and Prevention，Zibo 255026，China；2.Hangzhou Medical College，Hangzhou 310053，China）

A rapid and accurate method for detecting pinephrine，norepinephrine，dopamine，serotonin hydrochloridein human urinewasdeveloped.Themonoamineneurotransmitterswere extracted from human urine samples with Waters Oasis WCX solid phase extraction（SPE）cartridges. Then 2 mL 20 mmol/L ammonium acetate-methanol solution，2 mL methanol were used for eluting impurities.Finally，the analyte were extracted by 5 mL acetonitrile-water solution（85∶15，ν∶ν）containing 2%formic acid.The separation was performed on Agilent C18 capillary column（250mm× 4.6 mm，5 μm）followed by different proportion of methanol and sodium acetate solutions gradient elution.Four monoamine neurotransmitters in human urine were detected by high performance liquid chromatography with fluorescence detection（excitation wavelength 280 nm， emission wavelength 340 nm）.The results showed the average recoveries were between 92.2%and 104.8%，the relative standard deviations were between 1.6%and 3.1%，and the limits of detection were between 0.002μg/mL and 0.05μg/mL.The method used in this study is stable，fast and easy.The method has practical value for detecting monoamine neurotransmitters in human urine．

monoamine neurotransmitter；solid-phase extraction；high performance liquid chromatography；fluorescence detection

A

：1674-5124（2017）02-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.012

2016-10-10；

：2016-11-29

浙江省科技廳分析測試項目（2015C37009）；浙江省大學(xué)生創(chuàng)新科技計劃（新苗項目）（2015R436003）；2014年浙江省高等學(xué)校訪問學(xué)者專業(yè)發(fā)展項目（FX2014132）

高 慧（1979-），女，山東淄博市人，主管技師，研究方向為理化檢驗。

王 旭（1980-），女，山東聊城市人，教授，博士，主要從事衛(wèi)生理化檢驗研究。