酸櫻桃種子提取物對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用及其機(jī)制研究

史棟梁，史桂榮

（1.河南省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科，河南 鄭州 450002；2.商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 商丘 476100）

·論著·

酸櫻桃種子提取物對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用及其機(jī)制研究

史棟梁1，史桂榮2

（1.河南省中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科，河南 鄭州 450002；2.商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 商丘 476100）

目的觀察酸櫻桃種子提取物（SCE）對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，并探究其潛在的作用機(jī)制。方法隨機(jī)將36只Sprague-Dawley（SD）大鼠分成對照組、模型組、CoPP處理組及SCE低、中、高劑量組（分別為10、20和30 g/kg），前3組生理鹽水灌胃3 d，后3組上述劑量的SCE灌胃3 d；除對照組外，其余各組誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）模型。于0、12、24、36和48 h測量各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腫脹度，并抽取48 h時(shí)動(dòng)脈血，用試劑盒檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及前列腺素E2（PGE2）含量；Western blot檢測腫脹組織中過氧化物酶2、超氧化物歧化酶2（SOD2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達(dá)水平；對造模成功的大鼠，以6 mg/（kg·d）HO-1激動(dòng)劑（CoPP）灌胃2 d，測血清TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，腫脹組織中過氧化物酶2、SOD2及HO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果各SCE劑量組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)周長顯著小于模型組并呈濃度依賴性。與模型組相比，SCE可以顯著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，并提高SOD2和過氧化物酶2蛋白及HO-1表達(dá)水平。SCE通過提高HO-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)SOD2和過氧化物酶2表達(dá)水平，最終影響RA大鼠。結(jié)論SCE對大鼠RA有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能是SCE參與HO-1調(diào)控的抑制炎癥過程和增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力。

酸櫻桃種子；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎癥因子；氧化應(yīng)激

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上常見的慢性自身免疫結(jié)締組織疾病，表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)周圍組織病變[1-3]。RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，推測與遺傳因素、環(huán)境因素、微生物感染、免疫混亂和活性氧有關(guān)[4-5]。酸櫻桃富含酚類防老劑花青素、各種花色苷及其他黃酮類化合物，具有抑制腫瘤發(fā)展和預(yù)防心血管病發(fā)生的功效，其提取物的藥效越來越受到人們的重視[6-9]。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，酸櫻桃提取物具有抗氧化性，提示可能對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有潛在治愈能力[8-10]。本研究以RA大鼠為模型，觀察酸櫻桃種子提取物（sour cherry seed extract，SCE）對大鼠RA的作用，并對其潛在機(jī)制做進(jìn)一步研究，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，6～8周齡，雌雄各半，購于南京君科生物公司。室溫飼養(yǎng)，自由飲水，10 d后活動(dòng)和體征無異常后方可納入實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器

酸櫻桃去核榨汁（4℃保存），完全Freund’s佐劑（美國Sigma公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）檢測試劑盒（美國Diaclone公司），兔抗過氧化物酶2、兔抗超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、兔抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）及鼠抗β-actin（美國Santa Cruz公司），Chemidoc XRS凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RA大鼠模型建立選取SD大鼠36只，隨機(jī)分為對照組、模型組、CoPP處理組和SCE低劑量組（10 g/kg灌胃）、中劑量組（20 g/kg灌胃）和高劑量組（30 g/kg灌胃），每組6只。對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。灌胃3 d后在每只大鼠右后肢后跖皮下注入0.1 ml完全Freund’s佐劑（對照組除外），用于制備RA大鼠模型。并與0、12、24、32和48 h測量各組大鼠右踝關(guān)節(jié)周長。

1.3.2RA大鼠CoPP處理為驗(yàn)證HO-1對大鼠關(guān)節(jié)炎的影響，以6 mg/kg的HO-1激動(dòng)劑CoPP對建模成功的RA大鼠進(jìn)行灌胃，為CoPP處理組。48 h后酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2含量，并利用Western blot檢測大鼠關(guān)節(jié)炎處HO-1、過氧化物酶2和SOD2的表達(dá)水平。

1.3.3大鼠血清炎癥因子含量檢測48 h后，分別從對照組、模型組、SCE中劑量組及CoPP處理組的大鼠股動(dòng)脈取血5 ml，靜置30 min后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫肨NF-α、IL-1β、IL-6及PGE2檢測試劑盒測定對應(yīng)物質(zhì)含量，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.4Western blot檢測處死取血清后的大鼠，并于踝關(guān)節(jié)上0.5 cm處剪下腫脹足，去皮后剪碎，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次后加入細(xì)胞裂解液，4℃、20 000 r/min離心1 h，取上清液保存于-20℃冰箱備用。將總蛋白加入2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，1 000℃變性5 min，上樣后電泳2 h，電轉(zhuǎn)30 min。洗膜緩沖液封閉1 h后加兔抗過氧化物酶2、SOD2及HO-1過夜孵育。再洗膜3次×10 min，加入標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。洗膜3次×10 min后用凝膠成像分析儀檢測并保存圖像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析及LSD多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SCE對RA大鼠踝關(guān)節(jié)周長的影響

與對照組比較，模型組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腫脹更明顯（P＜0.05），表明RA造模成功。隨著SCE濃度的增加，RA模型大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重程度得以緩解，SCE對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果呈劑量依賴性（P＜0.05）。SCE高劑量組大鼠與同一時(shí)間的模型組比較，踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕（P＜0.01），表明SCE對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療效果明顯。見表1。

表1 各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)周長比較（n=6，mm±s）

表1 各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)周長比較（n=6，mm±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01；4）與SCE中劑量組比較，P＜0.05

足踝關(guān)節(jié)周長0 h12 h24 h36 h48 h對照組7.19±0.117.20±0.127.20±0.077.20±0.107.19±0.18模型組7.21±0.237.35±0.248.62±0.281）9.54±0.611）10.82±0.671）t值8.75610.2724.5344.7893.942 P值0.2700.1800.0450.0330.021 SCE低劑量組7.02±0.337.19±0.457.45±0.298.03±0.609.12±0.27 t值9.3649.2552.8962）2.0972）1.0962）P值0.8780.5640.0050.0040.003 SCE中劑量組7.10±0.237.20±0.377.37±0.282）7.91±0.552）8.91±0.472）t值7.3218.8964.6584.2254.035 P值0.5900.4900.0030.0020.001 SCE高劑量組7.08±0.457.17±0.487.29±0.387.88±0.398.54±0.22 t值9.6518.9633.2613）4）3.0253）4）2.8963）4）P值0.8600.9600.0010.0010.001 t值10.2569.6328.6986.9877.963 P值1.2300.9600.0420.0380.022組別

2.2SCE對RA大鼠炎癥因子的影響

模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量顯著高于對照組（P＜0.01）。經(jīng)過喂食SCE后，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量下降明顯，SCE對炎癥因子的抑制作用顯著（P＜0.01），提示SCE可能通過對炎癥因子水平的抑制來控制關(guān)節(jié)炎病情。見表2。

表2 各組大鼠血清不同炎癥因子含量比較（n=6，pg/ml±s）

表2 各組大鼠血清不同炎癥因子含量比較（n=6，pg/ml±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別TNF-αIL-1βIL-6含量PGE2含量對照組31.2±4.632.3±2.622.6±3.10.013±0.004模型組12.1±7.61）118.6±12.31）76.8±9.91）0.026±0.0061）t值11.50310.23612.36915.356 P值0.0010.0010.0010.016 SCE高劑量組39.4±3.72）48.5±7.52）35.5±3.92）0.017±0.0032）t值12.56911.36213.69816.897 P值0.0020.0020.0030.029

2.3SCE對氧化應(yīng)激的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組中過氧化物酶2和SOD2蛋白水平顯著高于對照組，而SCE處理組兩種蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步上升，表明SCE抗氧化應(yīng)激效果顯著（P＜0.05）。見圖1。

2.4HO-1參與SCE對RA大鼠的影響

RA大鼠踝關(guān)節(jié)處HO-1表達(dá)較對照組明顯增加（P＜0.05），而與模型組相比，SCE提高RA大鼠HO-1的表達(dá)水平，且呈濃度依賴性。HO-1誘導(dǎo)劑CoPP大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，CoPP能有效提高大鼠踝關(guān)節(jié)HO-1表達(dá)水平（P＜0.001）。CoPP提高大鼠過氧化物酶2和SOD2表達(dá)水平，抑制炎癥因子及PGE2表達(dá)，與SCE的作用相同，表明HO-1參與SCE對RA大鼠的調(diào)控。見圖2～4和表3。

圖1 SCE對氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

圖2 SCE對HO-1蛋白表達(dá)的影響及相對蛋白定量

圖3 CoPP對HO-1蛋白表達(dá)的影響

圖4 CoPP對過氧化物酶2和SOD2蛋白表達(dá)的影響

表3 CoPP對RA大鼠細(xì)胞因子的影響（n=6，pg/ml±s）

表3 CoPP對RA大鼠細(xì)胞因子的影響（n=6，pg/ml±s）

注：?與SCE高劑量組、CoPP處理組比較，P＜0.05

組別TNF-αIL-1βIL-6PGE2模型組105.3±5.1?116.3±10.6?79.4±8.7?0.024±0.005?SCE高劑量組39.4±3.748.5±7.535.5±3.90.017±0.003 CoPP處理組36.8±5.845.3±8.331.4±4.30.014±0.003 t值11.46110.37112.65213.421 P值0.0010.0010.0010.023

3 討論

酸櫻桃屬薔薇科李屬樹木，富含黃酮類化合物，能緩解關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)帶來的疼痛，并有抗癌、預(yù)防心血管疾病的功效[11]。酸櫻桃果實(shí)中含較高的有機(jī)酸，在一定程度上具有抗癌、抗動(dòng)脈硬化的功效。MAHMOUD等[12]最近對酸櫻桃種子提取物作用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的效果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)SCE對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有良好的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)用SCE灌胃的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯低于模型組，證實(shí)SCE對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有確切療效。

RA是以慢性滑膜炎為特征的自身性免疫疾病，盡管大量實(shí)驗(yàn)對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，但具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。普遍認(rèn)為，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，炎癥因子比正常人異常活躍，尤其是血清TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量與RA緊密相關(guān)[13]。TNF-α在RA患者機(jī)體中過量表達(dá)，而抑制TNF-α可以緩解RA病情[14]。IL-1β、IL-6及PGE2通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子和前炎癥因子的釋放，在RA滑膜病變、白細(xì)胞浸潤及軟骨侵蝕過程中，介導(dǎo)重要機(jī)體反應(yīng)[15]。研究表明，降低這些細(xì)胞因子在RA內(nèi)的水平可以降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，有效抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[13]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量明顯高于對照組，而SCE治療組血清中兩種炎癥因子的水平較模型組大幅回落，表明SCE可能通過降低血清TNF-α和IL-1β含量對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎起治療作用。

氧化應(yīng)激被視為誘發(fā)RA的原因之一經(jīng)TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)后，機(jī)體內(nèi)SOD和過氧化物酶2表達(dá)量明顯上調(diào)，清除病變中過多的活性氧，加強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，從而減輕炎癥程度[16]。本實(shí)驗(yàn)中酸櫻桃種子提取物明顯增加SOD2和過氧化物酶2含量，強(qiáng)化清除自由基、抵抗氧化應(yīng)激及修復(fù)組織損傷的功能，也揭示SCE治療RA的一個(gè)潛在的機(jī)制。MA HMOUD等[12]也證明SCE通過調(diào)控血紅素氧合酶-1的表達(dá)，從而削弱氧化應(yīng)激，加強(qiáng)前炎癥因子信號通路，抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。HO-1可為一系列引起氧化應(yīng)激的刺激所誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括細(xì)胞因子、活性氧、一氧化氮、紫外線等[17]，同時(shí)也是機(jī)體對不利因素做出的保護(hù)性行為。HO-1對機(jī)體發(fā)揮抗炎癥、抗氧化、抗凋亡等生理作用，提示HO-1的保護(hù)性作用可應(yīng)用于多種疾病。BENALLAOUA等[18]發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的HO-1能夠緩解關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥程度。其原因可能是RA病變部位處于缺氧條件，核因子-κB和HO-1相關(guān)部位特異結(jié)合，增強(qiáng)HO-1表達(dá)，從而對關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生抑制作用[19]。本實(shí)驗(yàn)中，SCE可明顯提高HO-1的濃度；大鼠體內(nèi)特異性誘導(dǎo)HO-1后，過氧化物酶2和SOD2水平顯著提高，表明抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)。同時(shí)，HO-1抑制RA大鼠炎癥反應(yīng)，表明HO-1能調(diào)控RA病情。概括來講，SCE通過升高HO-1水平，刺激SOD和過氧化物酶2的表達(dá)量，加速清除活性氧，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激的能力，同時(shí)降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情。由此得出結(jié)論，對炎癥因子表達(dá)水平的下調(diào)和抗氧化能力的增加是SCE治療RA的潛在機(jī)制，為SCE應(yīng)用于抗RA提供重要理論依據(jù)，但有關(guān)SCE活性成分及其對應(yīng)的詳盡的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（申海菊 編輯）

Effect of sour cherry seed extract on rat with rheumatoid arthritis and its mechanism

Dong-liang SHI1,Gui-rong SHI2
(1.Department of Rheumatic Osteopathy,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450002,P.R.China;2.Shangqiu Medical College,Shangqiu,Henan 476100,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of sour cherry seed extract(SCE)on rat with rheumatoid arthritis and explore its potential mechanism.【Methods】A total of 36 SD rats were randomly divided into control group,model group,CoPP group,10,20 and 30 g/kg SCE treatment groups.The control,model and Copp groups were given physiological saline for 3 days while other groups were given 10,20 or 30 g/kg SCE by gavage for 3 days.The rheumatoid arthritis(RA)model was induced in the rats except for the control group.Swelling of the posterior ankle joints of the rats was measured after 0,12,24,36 and 48 h.Arterial blood was drawn at 48 h and the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin(IL)-1β,IL-6, prostaglandin E 2(PGE2)as well as uric acid were detected by ELISA kits.And finally peroxidase 2,superoxide dismutase 2(SOD2)and heme oxygenase-1(HO-1)in the swelling tissue were detected by Western blot.RA model rats were treated with 6 mg/(kg·d)HO-1 agonist CoPP by gavage for 2 days.The serum levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and PGE2 were measured by ELISA kits.The protein expression of peroxidase 2,SOD2 and HO-1 in the swelling tissue were examined by Western blot.【Results】The circumference of the posterior ankle joints of the treatment groups was shorter than that of the model group in a concentrationdependent manner.Compared to the model group,SCE in the treatment groups greatly inhibited the serum levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and PGE2 but increased the levels of peroxidase 2,SOD2 and HO-1.SCE-1 might mediate the expression of peroxidase 2 and SOD2 through regulating HO-1,leading to the relief of RA in rats.【Conclusions】SCE has certain therapeutic effect on rats with RA,and its mechanism may be that SCE attenuates the inflammatory process and enhances the capacity to resist oxidative stress by regulating HO-1.

sour cherry seed;rheumatoid arthritis;inflammatory factor;oxidative stress

R593.21

A

1005-8982（2015）32-0020-06

2015-04-28

史桂榮，E-mail：hbo_liu@126.com；Tel：13700838450