全自動核酸提取儀與手動提取組織DNA的效率比較

林丹義，張科平，許 潔，顏黎栩，駱新蘭，劉艷輝

近年，隨著眾多與疾病診斷、預后及治療相關的分子標志物的出現，以石蠟組織DNA為材料進行分子水平的基因檢測及篩查已成為臨床診斷及相關研究的常規手段。對于各種基因分析而言，重要的是能夠獲得足夠純度和數量的DNA[1]。DNA提取是分子生物學研究的一項基礎技術，其提取的質量好壞及數量的多少直接影響到分子生物學實驗的開展[2]。目前病理科所使用的DNA大部分為人工提取，使用全自動核酸提取儀提取DNA者占極少數。因此，本實驗由兩名分子實驗室技術員獨立完成對全自動核酸提取儀與手動提取核酸進行提取DNA效率的驗證比較。

1 材料與方法

1.1材料隨機選取廣東省人民醫院病理科存檔的10例具有代表性的福爾馬林固定石蠟包埋組織標本，包括手術標5例，小標本5例；腫瘤組織8例，非腫瘤組織2例。

1.2試劑與儀器石蠟標本DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購于德國Qiagen公司，水浴鍋(上海一恒科技公司)，低溫離心機(Thermo Fisher Scientific)，QIAcube全自動核酸提取儀(Qiagen公司)，Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific)。

1.3方法每例連續切片21張，5 μm厚，編號1～21，其中編號為雙號切片用于手動DNA提取，單號切片用于全自動核酸提取儀提取。編號21玻片要求HE染色質控。切片貼于干凈的載玻片上，置于75 ℃烤箱烤30 min。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色所選取的腫瘤區域，小心地用無菌刀片將組織刮入1.5 mL EP管中。加入200 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，吹打混勻，置于56 ℃的水浴鍋中消化過夜。

1.3.1手動DNA提取 將過夜消化的組織從水浴鍋中取出，加入200 μL Buffer AL震蕩混勻，置于70 ℃水浴鍋孵育10 min，再加入200 μL無水乙醇充分吹打混勻，小心地轉移至2 mL吸附柱中，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；加入500 μL Buffer AW2，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；將吸附柱轉移至干凈的收集管中，真空離心12 000 r/min×3 min；將柱子轉移至干凈的1.5 mL EP管中，加入30 μL RNase Free H2O于膜中央，室溫孵育3 min，8 000 r/min離心1 min，收集產物。

1.3.2全自動核酸提取儀DNA提取 首先選擇所需要的程序，根據程序的指引放置相應的tip槍頭，放好DNA提取試劑，根據提示spin column和收集管置于適配器上，將前面所述的過夜裂解物放置在樣本架上，確認每一步操作均無誤后，關閉QIADcube門，運行程序。運行結束時，在觸摸屏上會顯示一個信息，確認樣品已被處理，從轉子適配器中取出含已純化核酸的離心管。

1.4DNA濃度及純度測定使用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度，分別記錄濃度及OD260/OD280。

1.5統計學分析全部數據采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，組間數據統計用單因素方差分析。

2 結果

本組實驗由兩名操作者進行驗證，操作者1手動提取DNA的總量為13 628.5±4 902.7，使用全自動核酸提取儀提取DNA的總量為9 121±3 264.3；操作者2手動提取DNA的總量為8 073.5±2 743.6，使用全自動核酸提取儀提取DNA的總量為6 181.5±2 135。上述結果提示，與手動提取DNA相比，全自動核酸提取儀提取DNA總量均較低，兩者相比差異有統計學意義(P1=0.037，P2=0.030)。不同人員操作的全自動核酸提取儀提取的DNA總量差異無統計學意義(P=0.061)。不同人員手動提取的DNA總量差異有統計學意義(P=0.032)。OD260/OD280的比值波動范圍保持在1.7～2.2。

3 討論

近年來，隨著分子生物學技術的發展，分子病理學應運而生，現已成為病理學科發展的重要方向。隨著現代醫療模式進入個體化時代，許多遺傳病、傳染病及腫瘤的治療已采用這一模式，如腫瘤的分子靶向治療就是個體化醫療最好的體現。目前能進行靶向治療的腫瘤種類越來越多，如淋巴瘤、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、胃癌、胃腸間質瘤、惡性黑色素瘤等，其基礎就是建立在準確的腫瘤分子病理診斷上。影響分子病理診斷質量的因素有很多，歸納起來主要有標本質量、分子病理實驗室建設、實驗室技術員、病理醫師的培訓和分子病理診斷的規范化等。提取高濃度和高質量的DNA是臨床分子病理檢測的基本保證，隨著分子生物學技術的快速發展，對福爾馬林固定石蠟包埋組DNA提取的也要求越來越高，要求所提取的DNA濃度及純度都要滿足快速發展的分子病理檢測[3]。

目前，國內有許多文獻報道關于DNA提取方法的改進，如一步消化法、脫蠟消化法、試劑盒法等[4-5]。這些方法的改進僅限于手動提取DNA，而對于全自動核酸提取儀提取DNA的效率驗證則極少有相關報道。本組實驗結果顯示，人工提取的DNA質量要高于全自動核酸提取儀提取的DNA質量，而不同人員操作全自動核酸提取儀所得到的DNA質量無明顯差異，不同人員手動提取的DNA質量差異明顯，原因可能是手動提取的DNA由于每個人的操作習慣及熟練程度不同，導致誤差較大，使得提取的DNA質量差別較大，而全自動核酸提取儀由于人為因素參與較少，客觀性較強，所以每次提取的DNA質量較穩定，差異不明顯。但是，無論是手動提取的DNA還是全自動核酸提取儀提取的DNA，其OD260/OD280均保持在1.7～2.2之間，符合石蠟標本PCR檢測的要求。全自動核酸提取儀提取DNA的優勢在于即使不同人員操作儀器，提取的DNA質量及純度都比較穩定，且避免了手工提取過程中人為的失誤及人力投入；缺點則在于提取的DNA質量比手動提取的效率低，小標本組織的DNA含量本身就低，經全自動核酸提取儀提取后DNA質量過低，可能會造成標本無法用于分子病理檢測；而手動提取DNA的優勢則在于提取的DNA質量高，用時短，對于DNA含量低的標本可以人為地調節純化體積，從而提高DNA的質量，更利于臨床小標本的分子病理檢測；缺點在于不同人員提取的DNA質量差異明顯，不確定性比較大。手工操作與每個操作者的熟練程度和細心程度密切相關。儀器檢測更客觀、一致，更易標準化[6]。

全自動核酸提取儀和手動核酸提取均有各自的優缺點，每個病理科分子實驗室應該根據自身實驗室的實際條件進行選擇最合適的方式，提取符合PCR要求的DNA，確保各項分子病理檢測順利進行。

[1] 鄭建明. 應特別重視分子病理診斷的質量[J]. 診斷病理學雜志, 2014,21(6):339-346.

[2] 時珊珊, 王建東, 馬恒輝, 周曉軍. 不同組織DNA提取的比較[J]. 診斷病理學雜志, 2013,20(8):508-510.

[3] 江 煒, 劉衛平, 李 雷, 李甘地. 石蠟包埋組織快速DNA提取方法在診斷病理PCR分析中的應用研究[J]. 四川大學學報(醫學版), 2007,38(4):709-712.

[4] 張惠丹, 任 輝, 王曉楠, 方 瑾. 一種從石蠟包埋組織中快速提取DNA的方法[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2010,26(5):590-593.

[5] 蔣金芳, 龐麗娟, 李洪安, 等. 石蠟包埋組織中3種DNA提取方法的比較及優化[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2012,28(8):939-941.

[6] 張 睿, 葉阿里, 竇亞玲, 等. 全自動核酸提取工作站對人乳頭瘤病毒分型檢測的可行性[J]. 中華醫學雜志, 2015,95(46):3775-3777.