傳統發酵蔬菜中微生物多樣性研究進展

李鋒，孫美娟

(1.黔南民族師范學院 化學化工學院，貴州 都勻 558000；2.百色學院 材料科學與工程學院，廣西 百色 533000)

傳統發酵蔬菜中微生物多樣性研究進展

李鋒1，孫美娟2

(1.黔南民族師范學院 化學化工學院，貴州 都勻 558000；2.百色學院 材料科學與工程學院，廣西 百色 533000)

傳統發酵蔬菜是我國蔬菜加工產品的重要產品之一，它以新鮮蔬菜為原料，通過多種微生物混合發酵而成。微生物發酵對其風味、質量有著重要影響，因此探討研究微生物多樣性對營養成分和風味物質的變化有著重要意義。回顧了國內外有關蔬菜發酵微生物多樣性的研究現狀并進行了綜述，以期為推進傳統發酵蔬菜產業的規模化發展提供技術資料。

發酵蔬菜；微生物；多樣性；發酵

發酵蔬菜是由微生物混合發酵而成，它在我國非常普遍且消費量很大。其加工工藝簡單、制作成本低、具有多種口味，能夠滿足大眾口味需求。我國傳統發酵蔬菜食品多種多樣，如東北酸菜、涪陵榨菜、四川泡菜、獨山鹽酸菜、河南酸菜和揚州醬菜等[1]。現代科學研究證明發酵蔬菜食品中含有豐富的益生菌，具有一定的調節腸道菌群平衡，降低膽固醇等功能[2]。隨著人們對發酵蔬菜食品營養價值的進一步重視，國內外學者開始著手從微生物多樣性對食品風味、食用安全性等方面進行系統研究。本文對發酵蔬菜中微生物多樣性進行了綜述，以期為篩選優良菌株制作高品質發酵制劑，并推進我國傳統發酵蔬菜食品規模化生產與發展提供參考資料。

1 傳統發酵蔬菜

發酵蔬菜是以蔬菜為原料，經過酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物混合發酵而成風味食品，因地域不同，加工各異不同，風味也各異。它不僅保留蔬菜的營養成分如氨基酸、膳食纖維和維生素C等營養物質，而且富含益生菌等功能微生物。我國傳統發酵蔬菜大多還是采用自然發酵的加工工藝，發酵周期較長，規模小，并且發酵過程中微生物區系復雜多變，產品風味不穩定定，嚴重制約我國發酵蔬菜產業的規模發展[3]。然而韓國、日本、美國等發達國家已經采用人工接種進行發酵蔬菜，并實現規模化生產。其中韓國和日本泡菜產業尤為迅速，尤其以韓國泡菜最為有名[4]，韓國泡菜已經發展成為純粹的工業化產品，是韓國重要出口食品之一。

近年來食品安全問題層出不窮，其中發酵蔬菜食品營養價值和食用安全問題也逐漸被重視，許多學者開始關注微生物與發酵蔬菜風味品質及食用安全之間存在怎樣微妙的關系。蔬菜發酵過程涉及多元的物理化學變化，這些變化會直接影響食品的質量與安全，微生物正式這些變化的“元兇”[5]。通過研究蔬菜發酵過程中微生物的動態變化對形成風味好，質量高的產品至關重要[6]。因此要實現發酵蔬菜從傳統自然發酵到人工接種的轉變，必須了解發酵過程中微生物的動態變化區系[7]。

2 國外發酵蔬菜微生物多樣性研究進展

近幾十年來，國外研究人員相繼對發酵蔬菜中微生物區系分布、優良菌株選育、發酵條件對微生物活動及有害微生物的影響等進行了相關研究，并取得較好成果。美國Feming課題組對酸菜中微生物區系研究較早且全面[8]，研究結果表明圓白菜發酵分兩個階段(初始異型發酵和后續同型發酵)發酵過程中的主體微生物為乳酸菌，利用形態學和生理生化反應鑒定出4種乳酸菌，分別為：Leuconostocmesenteroides、Lactobacilllusbrevis、Pediococcuspentosaceus和Lact.plantaum。Vethachai等[9]從酸菜中篩選分離出686株菌，利用DNA指紋圖譜技術分析表明，其發酵過程中存在更加多樣化乳酸菌種類，包括檸檬明串珠菌、阿根廷明串珠菌等，同時發現一種新菌種(Leuconostocfallax)。

關于發酵蔬菜方面研究及規模化生產，不得不提國外發酵蔬菜的代表—韓國泡菜(Kimchi)，已經被列入教科文組織人類非物質文化遺產名錄。韓國泡菜種類多達190種，銷往全球100多個國家。韓國泡菜能夠規模化發展，得益于研究者對泡菜中微生物種類及功能的全方位深入研究，從而控制產品質量，使其工業化生產。Myungjin等[10]采用16SrRNA基因克隆庫方法，分析五種不同泡菜中微生物群落結構，結果發現乳酸菌占較大百分比，包括乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬，其中韓國泡菜中的一類菌種(Weissellakoreensis)在所有樣品中都存在，并且這些菌種占總菌數量的42.6%-82%。Hyun-JuEom等[11]研究德國泡菜、韓國泡菜、腌黃瓜前期發酵的微生物多樣性，從中分離出腸膜明串菌株，證明此菌是發酵過程中起主要作用的菌株，并還可以產葡萄糖蔗糖酶。Jung等[12，13]通過分析研究韓國泡菜菌群結構，發現異型發酵乳酸菌Leuc.Mesenteroides是其發酵過程的優勢功能菌，其可以改善產品風味。目前韓國很多泡菜企業已將其作為接種劑用于工業化生產。綜上所述可見通過研究發酵蔬菜微生物區系進行全面系統研究，可以促進泡菜行業的產業化發展。

3 國內發酵蔬菜微生物多樣性研究進展

我國發酵蔬菜種類繁多，如東北酸菜、四川泡菜、凱里酸湯、揚州醬菜等，但對其微生物多樣性研究相對起步較晚。為了弘揚我國發酵蔬菜的特色及其產業化生產，國內科研院所也已經開始探索其中微生物多樣及其動態變化的發酵機理，并取得一定進展。

發酵蔬菜中微生物多樣性起初大多采用傳統培養的方法進行篩選分離、鑒定。如：談重芳[14]等從河南林州泡菜中分離出15株乳酸菌，其中13株屬于乳桿菌屬的6個種，分別為：粒形乳桿菌、戊糖乳桿菌、發酵乳桿菌、植物乳桿菌、布氏乳桿菌和短乳桿菌；另兩株為腸膜明串珠菌。張蓓蓓等[15]以四川地區泡菜為主要分離源，從四川地區20多個市縣的180余份泡菜樣品中，分離到447株菌種，分屬于11個屬34個種。并首次確定了植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌等3個屬，17個種乳酸菌為主要優勢菌群。武俊瑞等[16]通過選擇性培養和形態學觀察，分別從5份不同產地傳統發酵酸菜汁中，分離純化篩選出4株耐酸性的乳酸菌，經16S rDNA序列分析鑒定分別為清酒乳桿菌和植物乳桿菌；由此可見自然發酵酸菜中可作為潛在益生乳酸菌分離篩選的資源庫。李欣等[17]采自大慶地區的傳統酸菜發酵液中分離得到14株菌株，經16S rDNA序列分析分別為：4株彎曲乳桿菌、3株清酒乳桿菌、5株植物乳桿菌、1株短乳桿菌和1株腸膜明串珠菌，其中6株菌株在pH為3.0的酸性條件下具有較強生存能力。Chao等[18]對臺灣客家部落傳統酸菜和福菜的五個不同發酵階段進行微生物多樣性，共篩選到119種乳酸菌，這些細菌歸屬于5個屬18個種，分別為：Enterococcus(1 species)、Lactobacillus(11 species)、Leuconostoc(3 species)，Pediococcus(1 species)和Weissella(2 species)。

傳統微生物培養方法不僅費時且受主管因素影響較大，對準確揭示蔬菜發酵過程中微生物多樣性存在嚴重缺陷。隨著分子生物學技術的發展，有學者采用聚合酶連變形凝膠電泳(PCR-DGGE)技術研究發酵蔬菜中微生物多樣性。李正國[19]采用傳統分離培養并結合16SrRNA作為分子標記的DGGE法，分析不同發酵時期榨菜中微生物菌群結構，共獲得7個屬細菌類群，其中乳酸菌屬是優勢菌群，明串珠菌屬是次優勢菌群；通過DGGE方法得到的11條16SrRNA優勢條帶序列，進行對比結果顯示明珠串菌的豐富度最高，是主要優勢菌群，乳球菌是次優勢菌群；研究證明傳統分離法結合DGGE法能夠更全面有效地分析榨菜發酵過程中微生物多樣性及動態變化情況。Liang等[20]通過利用PCR-DGGE研究不同廠家生產的泡菜中菌群結構，研究發現所有廠家泡菜中均有Lactobacillus、Alkalibacterium、Debaryomyces、Pichia、Candida、Debaryomyces的存在，但每家的優勢菌群又不盡相同。從敏等[21]采用PCR-DGGE技術分析東北酸菜發酵過程中細菌的動態變化，結果表明：酸菜發酵第40天多樣性指數達最高值，說明此時細菌種群多樣性最高；發酵過程中含豐富的乳酸菌，主要的優勢菌群為乳桿菌屬，包括植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、戊糖乳桿菌、唾液乳桿菌以及Iwatensis乳桿菌。其中發酵前期的優勢菌群為乳酸乳球菌和戊糖乳桿菌，而植物乳桿菌為發酵中后期的優勢菌種。李超等[22]研究東北酸菜傳統自然發酵過程中的真核微生物多樣性，在26S rDNA D1/D2區變性梯度凝膠電泳結果顯示發酵過程中真核微生物種類豐富。克隆文庫揭示發酵第12天時，真核微生物主要為未培養的Stramenopile和土壤真菌，發酵30天時，除上述兩類微生物外還包括Candidasake、Cystofilobasidiuminfirmominiatum、未培養Claclosporium和Tilletiopsiswashingtonensis。曹碧璇等[23]研究東北傳統酸菜自然發酵液中細菌多樣性和群落的組成結構，采用構建16SrRNA基因文庫的方法對酸菜成熟發酵液樣品進行了研究共獲得98個克隆子，經過16SrRNA基因全長序列分析，鑒定為7個屬，9個種，分別為Lactobacilluscoryniformis、Pediococcusparvulus、Citrobactermurliniae、Clostridiumintestinale、Lactobacillusmalefermentans、Lactobacillusplantarum、LeuconostoccitreumAchromobacterspanius和Enterobactercloacae其中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)片球菌屬(Pediococcuss)和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)為優勢菌，分別占64.29%，22.45%和8.16%，其他種類分別占1.02%～2.04%。田偉等[24]利用16SrRNA基因文庫分析傳統四川泡菜中的乳酸菌多樣性，通過分析共得到129個克隆子，經均鑒定為乳酸菌，分別歸屬于Lactobacillus和Pediococcus，所占比例分別為88.4%和10.1%；L.pentosus、L.plantarum和P.damnosus是其中的優勢菌種分別占50.4%、16.3%和10.1%，L.paraliment-arius、L.sunkii、L.brevis、L.kisonensis、L.acetotolerans、L.namurensis分別占7.8%、4.7%、3.1%、1.6%、0.8%和0.8%，且P.damnosus、L.paralimentarius、L.sunkii、L.kisonensis和L.acetotolerans均在泡菜中發現。Yang等[25]對酸菜發酵過程中微生物動態變化進行了研究，發現發酵體系中存在Leuconostocmesenteroides，Lactobacilluscurvatus，Lact.Plantarum，Lact.Oligofermentans，Candidasake，Cystofilobasidiuminfirmominiatum，Claclosporiumsp.和Tilletiopsiswashingtonensis.在發酵六天后，乳酸菌占到菌群數量的63.8%，第30天的后就只能檢測到乳酸菌。Wu等[26]通過研究東北自然發酵酸菜微生物多樣性，發現細菌比真菌具有更豐富多樣性，其中14種細菌歸屬于Leuconostoc、Bacillus、Pseudomonas和Lactobacillus，Debaryomyceshansenii、Candidatropicalis和Penicilliumexpansum為真菌優勢菌種。

盡管PCR-DGGE技術能夠對環境中不能培養微生物進行鑒定，但其存在通量小、分辨能力低、背景噪聲影響大和條帶分析困難等問題，無法全面分析環境中微生物多樣性。近年來Illumina高通量測序技術的出現，可以準確測定環境中微生物多樣性，且具有較高通量。佟婷婷等[27]以泡菜母水作引子的蔬菜發酵過程中細菌多樣性變化，采集發酵過程中不同發酵時間的樣品，提取基因組，PCR擴增16SrRNA的V3+V4區并進行Illumina高通量測序，通過生物信息學分析比較發酵不同時間細菌多樣性結果表明：以老壇水作引子的發酵過程中發酵啟動時魏斯氏菌屬可達到74.5%，而之后則在10%左右，取而代之成為優勢菌的是乳桿菌屬，含量達到80%～85%說明泡菜發酵中啟動菌為魏斯氏菌屬，發酵的關鍵菌為乳桿菌屬，同時表明四川泡菜是優良的微生物資源，可用于魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬等益生菌的分離和篩選。張璐璐等[28]利用基于16SrRNA基因高通測序的方法對從貴州、廣西和四川采集的28個酸菜樣品中的微生物群落進行了分析，結果表明在我國酸菜樣品的微生物群落中乳酸菌占據絕對的優勢，分布在Lactobacillus、Pediococcus、Lactococcus、leuconostoc和weissela5個屬中，并且主要集中在Lactobacillus和Pediococcus兩個屬中，Lactobacillus在四川，廣西和貴州這3個地區的手工酸菜樣品中的含量并無顯著差異；Pediococcus則重要集中在貴州(52.60%)和四川(43.26%)這兩個地區，在廣西的手工酸菜樣品中的含量比較低，僅有4.25%；Leuconostoc只分布在四川和貴州兩個地區，在廣西的酸菜樣品中并沒有檢測到；而Weissela和Lactococcus主要分布在四川地區的手工酸菜樣品中，在廣西和貴州地區的樣品中含量很低。在所有酸菜樣品中，占據最優勢地位的乳酸菌種為Lactobacillusacetotolerans。左勇等[29]利用高通量測序技術對宜賓芽菜6個不同發酵期間的微生物多樣性和優勢菌群進行研究，共測得22 128 844條序列，通過聚類分析共產生1 198個OTU分類，比較充分地展示了發酵過程中真菌群落結構，并且發現了大量的非培養真菌和未分類真菌。

4 展望

國內外學者相繼對發酵蔬菜中的微生物區系、選育優良菌株、發酵條件對微生物活動及有害微生物的影響等進行了相關研究，并取得較好成果。進一步了解微生物區系動態變化，更有助于調控改變微生物菌群和感官品質的低鹽發酵。在現代蔬菜加工工藝中人們越來越重視采用優勢菌種來實現對產品質量控制，保證產品的安全性和質量的穩定性。

由于傳統發酵蔬菜自然發酵過程中微生物區系復雜多變，以往研究采用傳統培養方法結合PCR-DGGE技術鑒定微生物種類；但是99%的微生物是難培養或不能培養的，所以傳統分離方法對于全面了解泡菜中的細菌多樣性具有局限性。近年來，宏觀基因組學的發展及應用為揭示復雜體系中微生物的群落結構提供了強有力的工具，但起初由于基因信息數量巨大，受到測序手段的限制，而隨著高通量測序技術的發展，人們開始通過對整個泡菜基因組的分析來認識泡菜中的細菌多樣性。因此今后微生物多樣性研究熱點主要集中于利用高通量測序技術研究蔬菜微生態發酵過程，探究菌群與風味、品質之間的深層關系，開發優質接種劑，建立工業可調控系統，從而實現中國發酵蔬菜產業的自動化和產業化。

[1]盧曉黎，尼海峰.發酵蔬菜功能菌研究與應用進展[J].中國食品學報，2012，12(2)：1-6.

[2]焦巧芳，竺利紅，施躍峰.泡菜的營養保健價值及其規模化生產的研究進展[J].安徽農學通報，2009，15(7)：56-58.

[3]李德風，黎迅，劉焱，等.發酵蔬菜的安全性研究進展[J].中國釀造，2016，35(4)：11-14.

[4]張玉龍，胡萍，湛劍龍，等.發酵酸菜的研究及其進展[J].食品安全質量檢測學報，2014(12)：3998-4003.

[5]Nguyen D T L, Van Hoorde K, Cnockaert M, et al. A description of the lactic acid bacteria microbiota associated with the production of traditional fermented vegetables in Vietnam[J]. International journal of food microbiology, 2013, 163(1): 19-27.

[6]徐丹萍，蒲彪，敖曉琳，等.傳統泡菜中乳酸菌的研究現狀[J].食品工業科技，2013，34(19)：369-372，377.

[7]Hansen E B. Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future[J]. International journal of food microbiology, 2002, 78(1): 119-131.

[8]鄒慧芳，渠暢，吳昊，等.酸菜發酵過程中微生物多樣性的研究進展[J].中國調味品，2013，38(11)：107-112.

[9]Plengvidhya V, Breidt F, Lu Z, et al. DNA fingerprinting of lactic acid bacteria in sauerkraut fermentations[J]. Applied and environmental microbiology, 2007, 73(23): 7697-7702.

[10]Kim M, Chun J. Bacterial community structure in kimchi, a Korean fermented vegetable food, as revealed by 16S rRNA gene analysis[J]. International journal of food microbiology, 2005, 103(1): 91-96.

[11]Eom H J, Seo D M, Han N S. Selection of psychrotrophic Leuconostoc spp. producing highly active dextransucrase from lactate fermented vegetables[J]. International journal of food microbiology, 2007, 117(1): 61-67.

[12]Jung J Y, Lee S H, Kim J M, et al. Metagenomic analysis of kimchi, a traditional Korean fermented food[J]. Applied and environmental microbiology, 2011, 77(7): 2264-2274.

[13]Jung J Y, Lee S H, Lee H J, et al. Effects of Leuconostoc mesenteroides starter cultures on microbial communities and metabolites during kimchi fermentation[J]. International journal of food microbiology, 2012, 153(3): 378-387.

[14]談重芳，王晶晶，王雁萍，等.河南林州泡菜中微生物多樣性及乳酸菌種群的研究[J].食品科技，2010，35(7)：14-17.

[15]張蓓蓓，王柱，王憲斌，等.四川地區泡菜微生物的多樣性分析[J].食品與發酵科技，2016，52(191)：1-5，10.

[16]武俊瑞，李欣，張苗，等.自然發酵酸菜汁中乳桿菌的分離鑒定[J].食品科學，2012，33(15)：191-194.

[17]李欣，武俊瑞，田甜，等.大慶自然發酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及耐酸菌株初步篩選[J].食品科學，2014，35(1)：150-154.

[18]Chao S H, Wu R J, Watanabe K, et al. Diversity of lactic acid bacteria in suan-tsai and fu-tsai, traditional fermented mustard products of Taiwan[J]. International journal of food microbiology, 2009, 135(3): 203-210.

[19]李正國，付曉紅，鄧偉，等.傳統分離培養結合DGGE法檢測榨菜腌制過程的細菌多樣性[J].微生物學通報，2009，36(3)：371-376.

[20]Liang H, Zhang A, Wu Z, et al. Microbial Community Characteristics in Industrial Matured Chinese paocai, a Fermented Vegetable Food, from Different Factories[J]. Food Science and Technology Research, 2016, 22(5): 595-604.

[21]叢敏，李欣蔚，武俊瑞，等.PCR-DGGE分析東北傳統發酵酸菜中乳酸菌多樣性[J].食品科學，2016，37(7)：78-82.

[22]李超，張力群，劉通，等.東北酸菜傳統自然發酵過程中的真核微生物多樣性[J].東北農業大學學報，2015，46(9)：52-58.

[23]曹碧璇，胡濱，劉愛平.利用16SrRNA基因克隆文庫分析東北自然發酵酸菜中細菌多樣性[J].食品與發酵工業，2015，41(11)：76-80.

[24]田偉，張琦，鄧珍珍，等.利用16SrRNA分析傳統四川發酵泡菜中的細菌多樣性[J].食品科學，2013，34(17)：215-218.

[25]楊洪巖，李超，劉通，等.傳統東北酸菜發酵過程中的細菌動態及多樣性[J].食品工業科技，2015，36(1)：154-159.

[26]Wu R, Yu M, Liu X, et al. Changes in flavour and microbial diversity during natural fermentation of suan-cai, a traditional food made in Northeast China[J]. International journal of food microbiology, 2015, 211: 23-31.

[27]佟婷婷，田豐偉，王剛，等.基于宏基因組分析四川泡菜母水作引子的泡菜發酵過程中細菌多樣性變化[J].食品工業科技，2015，36(21)：173-177.

[28]張璐璐.我國傳統手工發酵酸菜和酸奶樣品中乳酸菌的多樣性分析及分離鑒定[D].上海：上海海洋大學，2016.

[29]左勇，王小龍，張晶，等.基于高通量測序技術的宜賓芽菜真菌多樣性研究[J].中國調味品，2016，41(4)：19-22.

[責任編輯 韋志巧]

Research progress of microbial diversity during the fermentation process of traditional fermented vegetables

LI Feng1，SUN Meijuan2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Qiannan Normal College for Nationalities, Duyun， Guizhou558000；2.School of Materials Science and Engineering, Baise University， Baise， Guangxi 533000，China)

The traditional vegetable is one of important products in china, which is fermented by microorganisms. The microbial fermentation has an important effect on the traditional vegetable of quality and flavor. Therefore, it is very important to study the fermentation mechanisms, microbial diversity and the change of nutrients, flavors and chemicals in fermentation process. In this paper, we review the microbial diversity during the fermentation of traditional vegetable. We expect to provide technique data for the industrialization of traditional vegetable in china.

traditional fermented vegetables； microbial； diversity； fermentation

Q93

A

1672-9021(2017)02-0031-05

李鋒(1982-)，男，河北石家莊人，黔南民族師范學院化學化工學院講師，碩士，主要研究方向：微生物功能。

貴州省教育廳自然科學研究重點項目(KY[2014]286)；貴州省科學技術聯合基金重點項目(LH字[2014]7418)；廣西高校中青年教師基礎能力提升項目(2017KY0725)。

2017-01-16