DNA甲基化在骨關節炎中的研究進展

謝慶云，魏 萌

(解放軍成都軍區總醫院 a.骨科；b.腎臟(風濕)科，四川 成都 610083)

·綜述·

DNA甲基化在骨關節炎中的研究進展

謝慶云a，魏 萌b

(解放軍成都軍區總醫院 a.骨科；b.腎臟(風濕)科，四川 成都 610083)

骨關節炎是一種最常見的肌肉骨骼系統疾病，但病因學尚不清楚。DNA甲基化狀態的改變可能參與了該病的病理生理學過程。現將對近期骨關節炎軟骨的靶向DNA甲基化分析，全基因組甲基化研究以及表觀遺傳治療在疾病中的應用予以綜述。

骨關節炎；DNA甲基化；關節軟骨；病因學

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性的肌肉骨骼系統疾病，可表現為不同程度的關節軟骨丟失、骨質增生、軟骨下骨改變和滑膜炎等， 后期將出現疼痛、關節畸形及功能障礙。OA是全球性主要的致殘性疾病之一，70歲以上人群OA的發病率約為40%，估計全世界膝OA患者數量約為2.5億[1]。OA主要的危險因素包括應力刺激、年齡、遺傳、炎癥、肥胖、損傷以及環境因素。到目前為止，OA的病因學尚不清楚，尤其是對發生影像學損害之前的早期分子生物學進程知之甚少。近幾年，表觀遺傳學已經成為OA嶄新且重要的研究領域。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，在OA發病中的重要作用相繼被報道。本文將對DNA甲基化在骨關節炎中的研究進展做一綜述。

1 表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是指在沒有發生DNA序列變化的情況下，基因表達和(或)表型所發生的可遺傳的改變[2]。在機體發育和細胞分化的過程中，表觀遺傳修飾能對基因的表達產生整體、動態和穩定的影響，使得細胞單位在有絲分裂過程中得以維持，細胞通過這種方式來調控基因的表達從而適應環境的變化。因此，每種細胞或組織的表觀遺傳組都是其特有的，并且對飲食、鍛煉和吸煙等內在或外在的環境因素產生時間和空間上的變化。

表觀遺傳修飾是通過調節基因的轉錄或者轉錄后環節來發揮作用，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA(ncRNAs)。在哺乳動物中，DNA甲基化一般發生在胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)，主要表現為胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶的現象。對于DNA甲基化功能的研究主要集中在基因的轉錄起始位點[3]。啟動子區域的甲基化可以抑制基因的表達，一方面CpG位點甲基化直接干擾轉錄因子與調控區DNA結合，另一方面甲基化的DNA與甲基化CpG結合區蛋白如MeCP2特異結合形成復合物，限制了轉錄因子達到它們結合部位的通道，從而抑制基因表達[4]。組蛋白修飾是指組蛋白在相關酶作用下發生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修飾的過程?；虻膯幼印⒃鰪娮印⑥D錄區域和沉默區域都有其自身獨特的組蛋白標記物，對轉錄組產生不同的影響[5]。ncRNA是一類能轉錄但不編碼蛋白質且具有特定功能的RNA分子，指各種不翻譯成蛋白質的RNA分子，包括微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)等，通過影響轉錄、剪切或翻譯來調節基因的表達[6]。

2 OA軟骨的靶向DNA甲基化分析

目前OA的DNA甲基化研究主要聚焦于關節軟骨，因為關節軟骨是疾病進程中受累的核心組織，易于在人工關節置換手術中獲取標本。此外，關節軟骨是由軟骨細胞單一類型細胞所構成，避免了多種細胞類型的組織會出現的遺傳異質性。2005年Roach等[7]進行的一項研究納入了晚期OA 16例和對照組10例，發現OA股骨頭關節軟骨的基質金屬蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13以及ADAMTS4的表達增加，并且與這些基因啟動子區域特定CpG位點的去甲基化相關。這是最早提出DNA甲基化在OA的發病機制中具有潛在作用的一項研究。此后，多項靶向DNA甲基化研究選取了從功能學上可能參與OA發病的基因，分別檢測了軟骨組織、原代軟骨細胞和軟骨細胞系中靶基因啟動子的甲基化狀態和mRNA表達水平。研究發現，OA的關節軟骨或者分離出的軟骨細胞中瘦素(leptin)、GDF5、NOS2、PHLPP1、SOST和IL-8基因的啟動子或增強子特定部位的去甲基化與這些基因表達的增加相關[8-11]，而OA關節軟骨中SOX9、SOD2和COL9A1啟動子的甲基化水平增加會下調這些基因的表達[12]。

然而，這些研究結果還不足以證明軟骨細胞DNA甲基化的改變參與了OA的發病機制，還需要進一步對這些關節軟骨樣本進行縱向研究，以發現甲基化的改變與基因表達、疾病表型之間的因果關系。盡管如此，甲基化的體外研究以及軟骨細胞與去甲基化藥物共培養的結果表明，DNA甲基化能夠直接影響甲基化差異區域。此外，OA關節軟骨MMP13、GDF5、SOX9和COL9A1的啟動子區域，NOS2的增強子區域內特定CpG位點的DNA甲基化狀態能夠改變轉錄因子的結合，從而影響基因的轉錄[8-9，12-13]。

雖然這些研究提示了DNA甲基化異常在OA發病機制中的潛在作用，但這些靶向性分析具有一定的局限性。首先，并不是基因調節區域的每一個CpG位點都能夠進行檢測，因此不能直接得出基因表達的差異與DNA甲基化的改變無關的結論。其次，這些研究關注的是已經發現的與OA有關聯的基因，因此無法鑒定出可能在疾病過程中具有重要作用的新通路。正因為如此，近3年來全基因組DNA甲基化的研究迅速開展起來。

3 全基因組甲基化研究

到目前為止，已發表的OA甲基化組學的研究大多數都是使用Illumina人類甲基化27K和450K磁珠芯片[14-20]。27K芯片能檢測位于14 500個基因的27 000個CpG位點的甲基化水平，而450K芯片則覆蓋了99%的RefSeq基因的485 577個CpG位點。其他的OA甲基化組學研究的檢測方法包括：簡化代表性亞硫酸氫鹽測序法(RRBS)[21]，Agilent人類啟動子芯片244K陣列[22]，或5′-羥甲基胞嘧啶抗體免疫共沉淀后測序(5hmC Me-DIP-seq)[23]。目前，Illumina公司已研發出更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)，包含了853 397個CpG位點[24]，但目前尚未見該芯片用于OA甲基化組學研究的相關報道。

關節軟骨的甲基化組學的研究策略主要有4種：①比較非OA關節軟骨和OA關節中未損傷的軟骨[15-16]；②比較髖OA和膝OA關節中完好的未被侵蝕的軟骨[16-17]；③比較同一個關節中完整的軟骨和被侵蝕的軟骨[18-19，22，25]；④比較體外培養的OA患者和非OA病例的軟骨細胞[23]。除了關節軟骨/軟骨細胞的甲基化組學，還有研究比較了骨質疏松患者和OA患者的股骨頭骨小梁[16]，以及相同關節中完整軟骨和被侵蝕軟骨所對應的軟骨下骨[20]。盡管只檢測了人類基因組2 800萬個CpG位點中的很小一部分，但這些研究為闡明OA相關的甲基化改變的基因組區域、這些改變所涉及的基因和通路提供了重要的信息。

這些研究所鑒定出的差異化甲基化CpG位點(DMSs)或差異化甲基化區域(DMRs)，大多數不在基因的啟動子區域，而是集中位于基因體、基因間隔區或增強子區域?；虻脑鰪娮涌赡苁钦{控另一個完全不同的基因的表達，而基因體的甲基化可能與mRNA的剪接和其他啟動子的轉錄相關[3-4]。這也許能解釋為什么髖OA和膝OA軟骨的DMRs中只有10%與所在基因的差異化表達相關[17]。因此，在對非啟動子區域含有DMSs/DMRs的基因進行基因本體和通路分析時需要考慮到這些因素，闡明甲基化的變化對基因表達的作用是一項充滿挑戰的工作。

盡管各項研究存在技術和生物學上的差異，但根據目前已發表的全基因組甲基化研究可以得出幾個關鍵性的結論。①髖和膝關節軟骨的甲基化組學是不同的，且與疾病的狀態或關節損害的程度無關[16-17]，甚至患者的相同關節也具有不同的表觀遺傳組學[15-16，26]。這些結果對疾病的診斷、治療和組織工程研究具有重要意義。②OA與非OA關節軟骨相比較[15-16]或者相同關節中完整軟骨和受侵蝕的軟骨相比較[18]，DMSs均富集位于具有免疫學功能的基因上。此外，髖OA和膝OA患者亞組的炎癥基因的甲基化發生改變[15-16]，對髖OA進行炎癥性聚類分析發現，這些變化與腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)1A、IL6、MMP13、ADAMTS5和鋅轉運體基因的轉錄增加相關[26]。這些研究提示DNA甲基化在調節關節軟骨的炎癥中具有重要的作用。轉化生長因子β(TGF-β)通路是OA重要的信號通路，該通路的組成部分及其下游靶基因富集了許多與OA疾病狀態[16]、疾病進展[19]、軟骨侵蝕有關的DMSs，而軟骨下骨也會發生甲基化的改變[18，20]，OA的軟骨細胞呈現低甲基化狀態[23]。③甲基化組學的研究為骨骼發育、肢體形態生成在OA易感性方面的作用提供了依據。編碼同源盒轉錄因子基因(包括在肢體發育中至關重要的Hox基因)的甲基化狀態在髖和膝關節軟骨之間[16-17]、晚期膝OA[19]和OA患者的股骨頭骨小梁[14]中均存在差異。④關節軟骨退變也會影響鄰近的軟骨下骨的甲基化組學，關節軟骨和軟骨下骨中ERK/MAPK，PI3K和NFAT信號相關的基因也出現了與損害相關的甲基化改變[20]。

軟骨細胞的甲基化組學具有異質性，受到關節來源、疾病狀態等因素的影響，因此要明確甲基化組學的差異如何通過分子生物學機制來改變軟骨細胞的表型，將是一項充滿挑戰性的工作。每一項甲基化組學研究都會鑒定出成百上千個DMSs/DMRs，因此很難確定選擇其中哪些位點或區域進行后續的功能學研究。選取DMSs/DMRs的方法之一，是選擇在多項相似試驗設計的研究中均被證實的位點或區域。但是，要比較不同的甲基化檢測技術所鑒定出的DMSs/DMR非常困難，因為需要對芯片技術和RRBS、MeDIP-seq等測序方法檢測出來的CpG位點的甲基化數據進行重疊，而這些數據并不是都能公開獲取。即使是同樣使用450K芯片的研究，由于探針的排除標準，P值的校正和閾值，判斷最小甲基化差異的顯著性水平都有所不同，這些研究所鑒定出的DMSs/DMRs也不能直接進行比較。盡管存在這些問題，數據庫中使用相似試驗設計的450K芯片所鑒定出的DMSs也有明顯的重疊部分。例如，兩項獨立研究鑒定出的髖OA和膝OA關節軟骨DMSs中，有34.1%的差異性位點是重疊的，并且表現為相同趨勢和相似程度的甲基化差異[16-17]。同樣，髖OA完整軟骨和被侵蝕軟骨的DMSs中約有71%在髖和膝樣本數據聯合分析時仍然存在甲基化水平的差異[18，25]。盡管髖和膝關節軟骨具有不同的表觀遺傳學特征，但非OA和OA膝關節軟骨的DMSs中有超過1/3的差異性位點在非OA和OA髖關節軟骨中表現出相同趨勢的甲基化改變[16]。由于關節軟骨樣本來自于不同的地理位置，那么這些研究中重疊的部位在很大程度上是獨立于環境因素的。因此，不受關節部位、OA亞型或者生活方式的影響，始終表現為相同甲基化改變的DMSs，是今后靶向研究的良好候選位點。

4 表觀遺傳治療在OA疾病中的應用

表觀遺傳修飾是不改變基因序列的修飾，相對基因治療更加安全。目前已有很多關于表觀遺傳修飾治療疾病的報道，主要是用于腫瘤及血液疾病的治療。目前最主要的修飾DNA甲基化的藥物是5-雜氮胞苷(5-AzaC)和5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)，先后于2004年和2006年被美國食品藥品監督局(FDA)批準用于血液系統腫瘤的治療。這兩種藥物均為DNA甲基轉移酶(DNMT)抑制劑，通過與DNMT共價結合，降低DNMT的生物活性，使抑癌基因去甲基化而被重新表達，因而已被成功用于血液系統疾病的治療[27]。在DNA甲基化修飾藥物的研究過程中，陸續發現治療心血管疾病的藥物具有一定的去甲基化作用，例如抗高血壓藥物肼屈嗪、抗心律失常藥物普魯卡因胺等[28-29]，此外研究發現中藥單體姜黃素具有抑制DNMT的作用[30]。但這些藥物去甲基化作用較弱，且作用機制不清，存在較多爭議，限制了其在臨床的應用。

目前已有部分學者嘗試將5′-雜氮-2′-脫氧胞嘧啶(5-Aza-dC)用于OA軟骨細胞的體外干預。Iliopoulos等[9]發現，5-Aza-dC能夠使軟骨細胞leptin啟動子甲基化水平降低、mRNA表達增加，繼而激活MMP-13。Kim等[31]報道OA關節軟骨細胞與10 μmol/L 5-Aza-dC共培養8天后，軟骨細胞 SOX-9啟動子區域的6個CpG島甲基化水平降低，定量PCR提示SOX-9 mRNA表達增加，蛋白印跡(Western-blot)檢測SOX-9蛋白表達增加。此外，5-Aza-dC與股骨頸骨折患者的軟骨細胞共培養5周后，COL9A1mRNA表達明顯升高，啟動子區域的CpG位點甲基化程度變化趨勢不一。而與OA軟骨細胞體外共培養的過程中，5-Aza-dC能降低COL9A1的DNA甲基化水平，增加COL9A1的表達[12]。但是，這兩種藥物對于DNMT沒有選擇性，特異性低，化學穩定性差，同時還具有腎毒性、骨髓毒性等副作用。因此，進一步研發高特異性、高選擇性、低毒性的DNA甲基化修飾藥物，靶向調節特定基因的DNA甲基化水平，啟動或抑制特定基因的表達，從而達到疾病的緩解，將是今后藥物開發的熱點。

5 今后OA DNA甲基化的研究方向

近幾年來OA關節軟骨的DNA甲基化研究尤其是甲基化芯片技術的應用，使我們對表觀遺傳學在OA中的作用有了更加深刻的理解。今后該領域的研究可以從以下幾個方面進行更加深入的探索。

第一，由于甲基化組學研究及其鑒定出的DMSs/DMRs的數量不斷增多，建立能夠整合研究結果的數據庫顯得尤為必要。鑒于大多數甲基化組學研究都使用Illumina芯片技術，應當對探針排除標準、基因注釋、多重檢驗校正方法、界定DMSs的P值和甲基化差異的閾值等達成共識。這將有利于研究間的直接比較，一項研究的數據可以用于另一項獨立樣本研究的驗證分析。此外，更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)的誕生和應用[24]，將為OA的DNA甲基化研究提供更多的信息和數據。

第二，整合遺傳學、轉錄組學和甲基化組學的研究數據。甲基化狀態和基因表達之間應當是相關的，但是某些相關性的缺失可能是由于過去認為對細胞沒有調控作用的因素造成的。這將有助于我們對基因表達臨時調控的認識。同樣，DNA基因型與不同的甲基化是否有關也需要進行評估。如果在OA遺傳學危險因素有關的DNA多態性位點上，等位基因的類型能影響到鄰近區域CpG位點的甲基化狀態，這將有助于解釋基因多態性如何影響OA的易感性。

第三，DNA甲基化研究應該擴展到關節其他組織?；?、軟骨下骨等其他受累部位也可能會提供有用的信息。此外，DNA甲基化的研究還應該擴展到比軟骨更易獲取的組織。人類組學研究的目標之一，就是能夠在更易獲取的組織中例如血液、唾液，檢測到在病變組織中所觀察到的異常改變，從而鑒別出尚未發病的易感人群。

第四，進一步研發具有特異性靶向作用的表觀遺傳修飾藥物。目前已有的DNA甲基化傳修飾藥物，其去甲基化作用缺乏特異性，不能靶向作用于某個特定基因并改變其DNA甲基化狀態，穩定性較差，毒副作用明顯，嚴重限制了其在疾病治療中的應用。因此，研發高效力、高選擇性的新一代DNA甲基化修飾藥物，靶向調節特定基因的表達，從而達到疾病的緩解，是今后藥物開發的方向之一。

今后，研究者們將通過遺傳學、轉錄組學和甲基化組學對參與OA發病的基因和區域進行更加詳細的功能學特征的闡明。總之，這些研究將有可能鑒定出OA新的病因學通路、疾病表型，發現新的診斷和預后的生物標記物，以及新的治療靶點。

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四川省科技廳重點研發項目(2017SZ0128);四川省衛生廳基金項目(130322)

魏萌，Email: weimengwm@sina.com

R684.3

A

1004-583X(2017)09-0824-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.09.023

2017-05-22 編輯:武峪峰