納米材料－蛋白質界面相互作用的分子機制

侯靜菲 楊延蓮 王 琛

(國家納米科學中心，中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室，中國科學院納米標準與檢測重點實驗室，中國科學院納米科學卓越創新中心，北京100190)

納米材料－蛋白質界面相互作用的分子機制

侯靜菲 楊延蓮*王 琛*

(國家納米科學中心，中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室，中國科學院納米標準與檢測重點實驗室，中國科學院納米科學卓越創新中心，北京100190)

納米材料由于其優異的性能在化工、電子、機械、環境、能源、航天等各個領域已經得到了廣泛的應用，并且在生物醫學方面的應用越來越受到重視。納米材料－蛋白質界面相互作用是納米生物醫學領域重要的科學問題，對于納米材料的生物醫學應用以及生物安全性評價至關重要。蛋白質分子與納米材料在界面的相互作用，一方面可以誘導蛋白質的構象、組裝結構甚至功能的改變，另一方面可以引起納米材料的表面親疏水性、電荷性質等表面物理化學性質的改變。基于蛋白質與納米材料相互作用檢測技術及結果，本文從分子水平闡述了納米材料與蛋白質分子在界面之間的相互作用機理及相應的結構與性質的變化，從而可以深化對兩者之間復雜的相互作用機制的理解，對于推進納米材料在生物醫學的應用及健康、安全、持續發展具有重要意義。

納米材料；蛋白質；界面；相互作用；生物醫學應用；分子機制

1 引言

納米材料獨特的電學、光學、力學、磁學、化學等特性在化工、電子、機械、環境、能源、航天等各個領域已經得到了廣泛的應用1,2。近年來，納米材料在生物醫學方面的應用越來越受到重視，如生物芯片、生物探針、核磁共振成像技術、納米體外診斷技術及納米藥物載體等3－6。納米材料由于量子限域效應具有獨特的光學性質，可以用于分子影像探針、體外診斷檢測探針等。例如，半導體量子點具有高的熒光量子產率，并且抗光漂白，可以實現對蛋白質的熒光標記從而可以實時跟蹤細胞水平的生物學過程，在細胞成像、腫瘤造影、組織染色和藥物運輸等方面已經有重要應用7；而貴金屬納米顆粒的表面等離激元特性也為納米材料帶來了特殊的消光特性，在免疫檢測等的診斷試劑、膠體金試紙條等方面已經有廣泛應用5,6；另外，其等離激元吸收引起的溫度升高也在腫瘤的光熱治療中表現了潛在的應用前景。納米材料具有高的比表面積，納米顆粒、納米管及納米片等納米材料，如聚合物納米粒、碳納米管(CNTs)、氧化石墨烯(GO)、金納米顆粒、多孔納米二氧化硅等可以作為藥物載體8,9，提高藥物的局部濃度。腫瘤組織對納米材料的增強通透性和滯留(EPR)效應可以實現藥物的被動靶向，通過在納米材料上修飾抗體、多肽及靶向小分子還可以實現藥物的可控釋放、腫瘤的靶向治療等10。很多納米材料(如碳材料納米顆粒、金屬及金屬氧化物納米顆粒、半導體納米材料等)還能夠引起包含DNA和蛋白質在內的生物分子的構象變化及細胞膜和骨架的改變，介導細胞的彈性、形態、運動、粘附及入侵等方面性能發生改變4，從而對細胞通訊、遷移、粘附、神經細胞的發育、干細胞的分化和增殖等產生影響。另外，納米材料與蛋白質、多肽等形成的復合材料(如生物礦化材料、有機無機雜化材料等)在組織工程學領域(如人工骨、人工支架等方面)的應用可以提高生物穩定性和組織相容性，同時降低生物毒性和免疫原性11－14。納米材料與蛋白質的相互作用在醫學診斷及治療方面引起了越來越高的重視，為當今研究的熱點。兩者界面之間相互作用的研究可以從分子水平揭示其作用機理，既是物理化學學科的重要科學問題，也是生物醫學領域應用的核心問題。

侯靜菲，1988年生。2011年畢業于北京科技大學，2011年至今就讀于中國科學院國家納米科學中心物理化學專業。主要研究方向為蛋白質/多肽分子相互作用、組裝規律及結構調控。

楊延蓮，國家納米科學中心研究員、博士生導師。分別于1996年和1999年獲得山東大學學士和碩士學位，2002年獲得北京大學博士學位。研究領域：疾病相關的多肽組裝結構及其調控的分子機制；基于掃描探針顯微技術的納米表征方法。

王琛，國家納米科學中心研究員、博士生導師、杰青、中國生物物理學會常務理事、中國真空學會理事等，1992年獲得美國弗吉尼亞大學博士學位。研究領域：掃描探針顯微技術及應用；單分子化學和物理性質；分子納米結構設計、構筑和表征等。

蛋白質主要是由20種天然氨基酸構成的生物大分子。氨基酸的排布方式、肽鏈的折疊方式使其形成具有空間構象和復雜功能的蛋白質分子，作為一級結構的肽鏈通過氫鍵、疏水作用等形成蛋白質的二級結構，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲等，進而通過氨基酸側鏈之間的疏水相互作用、鹽橋、氫鍵、范德華力和靜電力等卷曲折疊形成的球狀分子空間構象，這是蛋白質的三級結構，有些蛋白質還會通過多條肽鏈聚合形成更為復雜的空間三維結構，這是蛋白質的四級結構。根據側基的性質，氨基酸分為疏水、帶電荷、含芳香族側鏈、含硫及極性側鏈五類，不同性質的氨基酸之間的作用力大不相同。而納米材料的性質及功能也會隨著其尺寸、形態、晶體結構及表面化學性質的不同表現出很大的差異性。由于相互作用的本質對于不同的材料是具有共性的，因此納米材料與蛋白質的界面相互作用會受到二者表面物理化學性質的影響，而且會不可避免的通過界面相互作用改變納米材料以及蛋白質的結構和性質。蛋白質在納米材料界面的識別、結合及自組裝是熱力學驅動的過程，大多數條件下是吸熱的過程，受外界溫度、pH值等因素影響，其達到平衡態可以短至幾秒，長達數小時。蛋白質在納米材料表面的結合分為特異性結合及非特異性結合12，與蛋白質序列相關15。其次，界面的吸附和組裝受蛋白質物理結構16和化學基團17的共同影響。蛋白質的尺寸影響其在界面的分布速率，其空間構象還決定著與界面接觸位點的數量。蛋白質形成氫鍵的能力及其氨基酸帶電性、親疏水性等因素共同決定著蛋白質在納米材料表面的結合方式、速率及反應程度。另外，多肽或蛋白質在表面的吸附組裝還與納米材料表面的性質(尺寸、形狀、化學修飾等)和溶液條件等因素有關18－21。

蛋白質與納米材料的相互作用22,23一方面會對蛋白質的結構及功能產生影響，進而介導其生物效應發生改變。另一方面其還會對納米材料的物理化學性質產生影響，實現其功能化修飾。本文將主要從分子水平揭示蛋白質與納米材料的相互作用機理，并介紹納米材料與蛋白質相互作用對蛋白質結構功能及納米材料物理化學性質產生的影響，以及納米材料潛在的安全性及其帶來的挑戰。

2 蛋白質分子與納米材料的相互作用力

納米材料與蛋白質界面之間的相互作用及結合常數可以通過多種表征技術進行研究，如表面等離激元共振技術(SPR)24可以定量分析蛋白質與納米顆粒結合的動力學參數和熱力學平衡常數；石英晶體微天平(QCM)25可以定量測量納米材料與所吸附的蛋白質之間的作用力大小，并精確到納克級，也可以同時獲得動力學和熱力學參數；等溫滴定量熱法(ITC)26可以測得蛋白質相互作用的結合常數及其他熱力學參數，可以獲取納米材料與蛋白質分子之間的結合方式。利用掃描探針顯微鏡可以探測到蛋白質分子在納米材料表面的吸附及組裝結構，如利用掃描隧道顯微技術(STM)通過探針表面原子與樣品之間的隧道電流探測樣品在界面的吸附及組裝結構，達到原子級的超高分辨率27,28；利用原子力顯微技術(AFM)14可以探測到納米材料表面特征及蛋白質在界面的吸附組裝形貌。通過光譜技術還可以探測到蛋白質分子與納米材料相互作用過程中結構的變化，如圓二色光譜(CD)29在遠紫外光譜區的信號主要由肽鍵的電子躍遷引起，通過譜帶位置及強度的分析，可以實時監測吸附蛋白質的主鏈構象，包含α-螺旋、β-折疊、β轉角及無規卷曲等二級結構及三級結構的變化；傅里葉紅外光譜(FTIR)30可以通過蛋白質分子酰胺I帶及酰胺II帶的吸收變化來分析蛋白質在納米材料表面的吸附類型及結構變化；三維熒光光譜(3DEEMFS)31通過與主成分分析結合可以獲得納米材料與蛋白質相互作用過程中吸附蛋白質分子構象變化的信息。另外，動態光散射技術(DLS)32還可以表征蛋白質分子與納米材料結合的粒徑分布及zeta電位的變化，得到更多兩者相互作用的有效信息。

通常，蛋白質分子在納米材料表面的組裝過程是由兩者之間各種因素所共同決定的，由分子與分子之間多種相互作用力所共同驅動的。蛋白質與納米材料之間相互作用23的非共價驅動力主要有分子間疏水相互作用、靜電力相互作用、π－π相互作用、氫鍵相互作用、范德華及鹽橋相互作用等，不同作用力之間的比較見表1。

范德華力是蛋白質分子與納米材料界面相互作用最常見的短程弱相互作用力，兩者之間的距離越小，吸引力越大，并且每個原子都對相互作用有貢獻。通常在范德華力的驅使下，蛋白質分子與納米材料界面達到最大的接觸面積。因此，較大的納米顆粒與構象比較靈活的蛋白質之間會有比較強的范德華作用力23。由于大部分納米材料與蛋白質之間都存在范德華作用力，以下主要從疏水相互作用、靜電相互作用、π－π相互作用、氫鍵相互作用等方面介紹蛋白質分子與納米材料界面相互作用的分子機制以及納米材料物化性質對兩者界面相互作用的影響。

2.1 疏水相互作用

蛋白質由疏水氨基酸和親水氨基酸構成，通常蛋白質的折疊由疏水相互作用所驅動，疏水的側鏈包埋于蛋白質內部，形成疏水核心，而親水氨基酸則暴露于表面。蛋白質在疏水的納米材料界面，可能會暴露出疏水殘基，與材料界面發生疏水相互作用。而納米材料表面的親疏水性也會通過影響蛋白質接觸角而決定二者在界面的相互作用。研究證實疏水相互作用在核殼結構的材料組裝及淀粉樣纖維的形成中發揮著重要作用33。蛋白質比較容易吸附在疏水性表面，而且疏水性越強，蛋白質的吸附就越強34。

表1 蛋白質分子與納米材料之間相互作用力比較23Table 1 Comparison of different interactions between proteins and nanomaterials23

石墨烯由于在結構、機械、光、熱、電性能方面的優點在很多領域得到了應用35,36。石墨烯、石墨炔、碳納米管等碳納米結構的疏水界面、可功能化的性質也使其在生物醫學領域的應用嶄露頭角。HIV-1碳端的DNA結合域整合酶蛋白在溶液中形成二聚體，并且有一個比較明顯的疏水界面。Luan等37通過分子模擬(MD)分別研究了石墨炔與HIV-1整合酶蛋白四種變體(Sim-1、Sim-2、Sim-3和Sim-4)二聚體的動力學結合過程(圖1)。初始狀態下，石墨炔平面平行于蛋白質二聚體的疏水界面，經過幾十納秒之后，其穿過Sim-1和Sim-4的界面，使得蛋白質變為單體狀態，蛋白質單體與單體之間的接觸面積變為0。研究證實石墨炔與蛋白質二聚體界面疏水氨基酸(LEU242、TRP243、ALA248、VAL250、ILE257及VAL259)之間的疏水作用力要強于蛋白質單體與單體之間的作用力，從而導致蛋白質二聚體被石墨炔片層分隔開。另外，蛋白質的疏水核心很容易暴露于納米材料的疏水表面，引起蛋白質變性等38,39。

2.2 靜電相互作用

兩個物體在接觸并吸附的過程中，界面上由基團解離的相反電荷相互吸引，形成雙電層。DLVO理論認為溶膠的穩定性取決于膠粒之間相互作用的位能，包括范德華吸引位能及雙電層引起的靜電排斥位能。而蛋白質是一種生物大分子，具有膠體的性質。其表面的親水基團能吸引水分子，形成水化膜，與膠粒表面所帶的電荷一起維持蛋白質的穩定。蛋白質除了兩側的氨基和羧基可以解離外，氨基酸側基中的基團在一定的pH條件下也可以解離成帶正電或帶負電的基團，如組氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。它們通常有比較強的親水性而位于蛋白質的表面，從而通過電荷的分布與納米材料荷電表面產生靜電力相互作用。靜電力是一種常見的作用力，它也決定著蛋白質與納米材料的結合位點。當這些氨基酸位于蛋白質內部時，還可能通過去折疊暴露出相關氨基酸，通過側基與納米材料之間的靜電力發生相互作用。溶液pH會通過影響納米材料及蛋白質分子的帶電狀態，從而影響二者之間的靜電力相互作用。研究證實，蛋白質在帶電荷的納米材料表面比較容易吸附，其吸附程度略弱于疏水材料表面40。另外，蛋白質中一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基相互靠近時，通過靜電力吸引還會形成鹽橋。雖然鹽橋的數量較少，但它們對蛋白質結構的穩定十分重要，蛋白質分子內部、蛋白質與納米材料之間鹽橋的產生和破壞對于二者的相互作用也至關重要。

通過調控納米材料的界面電荷可以調控蛋白質在表面的吸附量和吸附構象。轉基因殺蟲蛋白Cry1Ab單體在SiO2等帶負電的基底表面的吸附，在靜電力的調控下吸附是可逆的，因此確保了蛋白Cry1Ab在基底表面比較高的構象穩定性，保證了其在土壤中生物活性不受損失41。另外，研究還發現并不是所有的氨基酸都參與組裝，Cry1Ab蛋白在SiO2表面的靜電力吸附并不能靠其凈電荷來解釋，而是受帶電氨基酸與界面之間的靜電力吸引所致42。

因為不同的氨基酸序列會造成蛋白質的電荷分布、疏水界面、氫鍵形成能力等的差異，所以不同材料表面對于蛋白質或者多肽的結合可能具有序列特異性。研究者們通過噬菌體展示技術篩選出與五種單晶半導體材料GaAs(100)、GaAs(111)A、GaAs(111)B、InP(100)及Si(100)有特異性結合的多肽序列43，通過重復洗脫來提高結合的特異性。研究發現與GaAs(100)基底表面結合的多肽表現出了氨基酸序列的相似性，他們包含一些能夠給電子的官能團，例如絲氨酸和蘇氨酸的側鏈都包含羥基，天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈都包含胺，只是分子組成上相差一個亞甲基，他們通過界面電荷之間相互作用在材料表面吸附和組裝。這種不同表面的多肽吸附的選擇性為工程化修飾納米材料表面提供了依據。GBP1是第一批基因工程篩選得到的可結合金表面的多肽，其序列為MHGKTQATSGTIQS44。一般基因工程通過多肽的重復序列來提高其結合活性，研究發現GBP1序列需要至少重復三次(3rGBP1)才能實現其與金表面的高親和性45,46。多肽3rGBP1溶液是無序結構，包含了重復的MHGKTQA無規卷曲結構及TSGTIQS延展結構47。研究證明，多肽分子帶電氨基酸(賴氨酸或組氨酸)的側鏈與金表面的靜電相互作用為多肽在晶面的組裝提供驅動力。另外，多肽分子間的相互作用也為維持其構象穩定做出一定的貢獻，在組裝的過程中使得多肽的構象重新調整，形成反平行的β片層結構，最終達到分子內部的穩定14,44。

圖1 石墨炔片層與蛋白質二聚體相互作用的動力學模擬Fig.1 Dynamics simulation of the interaction of the graphyne sheet with the protein dimer

2.3 π－π相互作用

蛋白質在納米材料表面的吸附強度不同，因序列和氨基酸的不同而異。某些芳香族分子(例如色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等)之間存在π－π堆疊相互作用，這種弱相互作用對蛋白質的組裝、結構及材料的調控起著重要的作用。兩種芳香環分子π－π相互作用的最常見構象是平行及T型。π－π堆疊的平均距離比范德華作用距離稍大，并且對sp2雜化碳納米材料與蛋白質之間的相互作用影響較大23。由于極少數的氨基酸含有芳香環，并且這些氨基酸通常會包覆于蛋白質的疏水核心，蛋白質與納米材料之間的π－π堆疊相互作用具有一定的特異性。

由于在電子及機械方面的優良性能，碳納米管在分子電子學及超靈敏生物傳感器方面有很大的潛能48。利用噬菌體和細胞展示技術篩選得到的與碳納米管特異性結合的多肽在納米管的分散、操縱及發展基于碳納米管的傳感器方面打開了新的大門。研究發現這些多肽的序列兩端是對稱的親水序列，作為表面活性劑與溶劑相互作用，中間是與碳納米管作用的疏水氨基酸，但是這些非特異性的疏水序列并不能主導多肽與碳納米管的結合強度49。而通過對碳納米管結合肽的肽鏈構象統計熱力學的計算，單個氨基酸出現頻率的分析，以及多肽序列的點突變實驗研究發現富含芳香環的色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸等氨基酸與納米材料之間的π－π堆疊相互作用力為其表面的吸附及結合發揮了重要作用50。其可以經受200°C的高溫，維持納米管的穩定性，對材料的發展及藥物的設計也十分重要。

富勒烯C60及其派生物可以通過與β-粉樣多肽(Aβ)的核心序列KLVFF的緊密結合來抑制其聚集51。包含KLVFFAE序列的Aβ多肽分別與C60、C60團簇(3C60)及C180共同作用，通過結構模擬及能量計算，發現3C60和C180比C60更能降低Aβ多肽的β-折疊二級結構，從而抑制其纖維化。通過AFM的表征還發現，富勒烯對Aβ纖維長度及高度的抑制跟濃度成正比。這種抑制作用是由于C60空腔與苯丙氨酸芳香族側鏈之間發生了π－π堆疊相互作用，從而破壞了纖維的穩定性52。研究還指出，多肽苯丙氨酸與富勒烯π－π堆疊相互作用的距離為0.45 nm(圖2)，C60與蛋白質相互作用首先由形狀互補所驅動，氨基酸的化學結構修飾到C60空腔。其次，芳香族及帶電氨基酸與C60之間的π－π堆疊為其結合提供驅動力。另外，研究還發現C60與其抗體Ab形成的穩定C60-Ab復合物也是由C60與色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸側鏈之間的π－π堆疊作用機制所主導的53。

圖2 富勒烯C60及其衍生物對Aβ多肽纖維化的抑制Fig.2 Inhibition of fullerene C60and its derivatives for theAβ peptide fibrosis

2.4 氫鍵相互作用

氫鍵是蛋白質組裝及與材料結合的主導驅動力，其形成是由于一個電負性較強的原子與氫原子鍵合后，又與另一個電負性較強的原子鍵合。氫鍵比范德華作用力強很多，但是納米材料與蛋白質之間氫鍵相互作用的總量遠遠小于范德華力作用。蛋白質的二級結構如α-螺旋、β-折疊和β轉角，就是靠氫鍵維持的。一些蛋白質構象病的致病機理是由于蛋白質的錯誤折疊形成纖維54,55，而纖維形成的主要驅動力就是多肽分子間氫鍵。往往蛋白質在與材料界面發生相互作用后，會發生包括二級結構、三級結構等高級結構的改變，過程中伴隨著氫鍵的打開與生成。

通過功能化的納米材料吸附具有生物學功能的蛋白質，可以提高蛋白質的功能、穩定性等。酶的固定對于其生物傳感器應用、臨床檢驗、污水處理等應用至關重要，納米材料的高比表面積、可功能化特性為高效酶固定提供了可能。碳納米管是出色的蛋白質固定支撐材料，并且有著較高的穩定性，可以有效地解決這些問題。多層碳納米管(MWCNTs)通過表面氧化再選擇性地去除某些含氧官能團(如羧酸、酚類、酐、內酯和醌類)，可以有效地提高過氧物酶的固定效率、催化活性、熱穩定性及操作穩定性56。研究證明，過氧物酶通過氫鍵與MWCNT400表面修飾的羥基基團相互作用形成MWCNT400-過氧物酶生物共軛體，從而提高了其熱穩定性57。

GO基于其出色的電子、力學及熱力性質，在高分子材料、能源材料、傳感器及生物醫學等領域很多方面有著良好的應用，是近幾年來備受關注的二維材料58－60。其具有大量的疏水表面和共軛電子結構，可以和蛋白質的殘基通過靜電力、疏水相互作用及π－π堆積相互作用，并且不通過任何交聯劑就可以達到很高的負荷量。研究發現，GO可與與II型糖尿病相關多肽hIAPP結合61。分子動力學模擬和圓二色光譜的結果顯示，GO可以誘導hIAPP的α-螺旋結構含量降低及無規卷曲結構含量上升(圖3)。另外，GO還可以抑制hIAPP的聚集，降低對細胞NIT-1的毒性。這是由于GO的碳原子可以與hIAPP的芳香族氨基酸通過π－π堆疊相互作用，其羥基還可以與多肽的極性氨基酸結合形成氫鍵。兩者之間較強的相互作用抑制了多肽的自組裝。

2.5 納米材料物化性質對界面相互作用的影響

生命體是一個龐大復雜的系統，其各個組織、器官及循環系統富含大量的生物分子，尤其是豐富的蛋白質。當納米材料進入到生物體系時，其表面和蛋白質分子及其他生物分子相互接觸，形成動態的納米材料-蛋白質冠62。隨著蛋白質的吸附與解離，最終親和力高的蛋白質在納米材料表面吸附及組裝，通過界面相互作用降低其表面能，從而達到穩定狀態。同時，納米材料的組成及表面物理化學性質會隨著時間發生變化，而這些變化反過來又會影響其在生物體內的吸收、生物轉化及生物相容性等63,64。納米材料的尺寸形狀、形貌及化學性質可以決定蛋白質的空間排列，從而影響蛋白質分子與納米材料之間的結合方式，進而影響蛋白質的功能及性質。

2.5.1 尺寸對納米材料-蛋白質相互作用的影響

納米材料在生物體內被內吞進入細胞之后處于酸性的環境，經過吸附、分布、代謝及排泄幾個過程，最后排出生物體。材料的生物降解速率及動力學過程受納米材料的大小和組成影響。大尺寸納米顆粒(尺寸大于100 nm)由于實體瘤的EPR效應在其血管的高度聚集可以實現腫瘤治療的被動靶向。另外，動力學直徑小于5 nm的納米顆粒可以很方便地被生物體排泄，從而避免了其在組織器官不必要的集聚65。

納米材料的尺寸還會影響相關蛋白質的聚集形式，例如GO對淀粉樣多肽Aβ(33－42)的聚集表現出尺寸效應66。制備從50到478 nm一系列尺寸大小的GO與淀粉樣多肽Aβ(33－42)共孵育。研究發現，尺寸較小的GO實驗組，多肽形成纖維，而隨著GO尺寸的增大，Aβ(33－42)的β-折疊二級結構含量逐漸減少，形成的淀粉樣纖維也越來越少，甚至消失形成薄膜。究其機理，可能是由于GO尺寸越小，其邊緣越多，能夠為淀粉樣纖維的形成提供更多的臨界成核點。

圖3 氧化石墨烯(GO)與多肽hIAPP結合的效應Fig.3 Effects of GO binding on peptide hIAPP

2.5.2 形狀對納米材料-蛋白質相互作用的影響

納米材料的曲率半徑可以影響其與蛋白質的結合。其曲率半徑越小，蛋白質與納米顆粒之間的親和力就越低。這是由于曲率半徑降低，納米材料與蛋白質的接觸面積減小，二者之間的相互作用力被削弱。而且，蛋白質與蛋白質之間的相互作用也為其在納米材料的吸附提供額外的驅動力，降低曲率半徑，就會增大吸附蛋白的偏轉角，從而降低蛋白質的吸附67。另外，納米材料的縱橫比還會影響其被細胞攝入的速率。例如由于尺寸的等效性，金納米微粒比金納米星更容易被細胞內吞68，而桿狀的納米顆粒也更容易通過蛋白質分子結合而被生物體內吞。

2.5.3 表面化學性質對納米材料-蛋白質相互作用的影響

納米材料界面的化學性質在生物體內的轉運、細胞攝取及催化方面扮演著重要的角色。其成分、涂層、電荷、配體的位置及表面濕潤度對蛋白質的吸附、生物分子的結構及功能有重要影響。具有電荷或者疏水表面的納米顆粒比親水表面更容易與蛋白質形成復合物，而且顆粒的疏水性越強，越容易與血漿中蛋白質或多肽的結合，從而提高其分散性69。疏水相互作用還可以促進顆粒的聚集，使之不會輕易被機體清除50。

通常，以診斷和治療為目的的納米材料為了到達細胞及疾病相關的靶點，會在其表面修飾特定的生物分子(多肽、配體等)或化學官能團。而通過改變這些修飾物的類型及密度還可以實現對材料與靶點受體之間的相互作用強度的調控70。材料表面的電荷性會影響其在生物體內的分布和代謝。例如，細胞的外表面是帶負電荷和親水的，提高材料表面正電荷的量可以促進其與細胞的結合，從而更容易被細胞攝取而進入細胞，在醫學上可以達到載藥的目的。研究證明，材料表面修飾聚乙烯亞胺(PEI)的效果要優于聚乙二醇(PEG)71，且聚合物長鏈的效果優于短鏈。但隨著分子量增大，高密度的陽離子會破壞細胞膜，造成細胞毒性。最優的分子量為10 kDa或者低于10 kDa72。另外，納米材料在特定的生物應用方面要盡可能降低與蛋白質的吸附，可以通過在材料表面修飾親水或中性聚合物，如PEG、多糖或者聚乙烯來實現73。

此外，研究發現ZnO和CuO納米顆粒在含有和不含胎牛血清(FBS)改良的eagle培養基(DMEM)培養基以及PBS磷酸緩沖液中都可以分散得很好74。證明納米顆粒可以在生物環境中與其他生物分子形成復合物，并且不依賴于血清蛋白。ZnO和CuO納米顆粒與培養基中各種成分表現出了不同的親和力(圖4)。例如，ZnO顆粒與Na的結合多于Ca，而CuO顆粒與Ca的結合要多于Na。這種選擇性的吸附與納米材料-蛋白質復合物的形成相似，都是由于材料表面的化學性質不同所導致的75。另外，DMEM培養基中含有和不含FBS，ZnO納米顆粒結合P和Cl量的多少完全相反。由此看出生物環境對納米材料的吸附特性也有一定的影響。通過DMEM培養基含有和不含FBS的X射線光電子能譜對比可以發現，FBS可以影響納米顆粒與離子的結合。而結合能峰位的偏移說明FBS蛋白質分子與納米顆粒結合形成蛋白冠。ZnO納米顆粒在去離子水中的zeta電位為負值，而在DMEM培養基中轉變為正值。這是由于納米顆粒結合了溶劑中的離子所致，與ZnO和CuO納米顆粒的選擇性吸附結果一致。

圖4ZnO及CuO納米顆粒在緩沖液中分散及選擇性吸附Fig.4 Disperse and selective binding of ZnO and CuO nanoparticles in the buffer

功能化修飾的GO由于具有超高比表面，在生物體系中可以用來運輸小分子藥物及生物分子，例如DNA及小干擾RNA等。GO表面的化學修飾可以對其界面的生物學特性帶來改變，例如，PEG修飾的氧化石墨烯nGO-PEG對動物沒有太大的毒性。另外，研究還發現76，GO在血漿中能夠非特異性吸附大量的蛋白質，而nGO-PEG不僅降低了對大多數蛋白質的結合，還提高了對特定蛋白質分子的選擇性結合(圖5)。六種已知的特異性蛋白質中有四種蛋白質是與免疫相關的因子，包含C3a/C3a(des-Arg)。而C3a/C3a(des-Arg)是由C3分裂產生的，在肥胖癥、糖尿病及心血管疾病等病人體內含量較高，與肥胖癥的發病機制有關。nGO-PEG與C3a/C3a(des-Arg)的特異性結合降低了血漿中C3a/C3a(des-Arg)的含量，對相關疾病的調節具有重要意義。

3 納米材料對蛋白質結構及功能產生的影響

蛋白質分子通過各種相互作用在納米材料界面吸附和解吸附，最終達到動態平衡，其原有的構象可能會被破壞，產生新的構象。其各種二級結構所占的比例77,78及高級結構也會發生變化，并影響蛋白質的聚集動力學、酶的活性、與配體的結合等生物功能及活性。本文結合一系列結構及其他表征技術從分子水平上揭示了蛋白質分子與納米材料界面相互作用對蛋白質分子組裝結構、聚集形貌以及生物效應帶來的影響。

3.1 蛋白質聚集動力學的變化

利用SPR及QCM對多肽3rGBP1與金表面較強的結合力79進行表征，研究表明其結合能與自組裝單層膜SAM相當，兩者在一個數量級。二者在水溶液里的結合速度很快(20 min內可以達到90%的覆蓋率)80，且在很寬的pH范圍內都保持構象穩定。高分辨AFM結果顯示多肽3rGBP1分子在金表面形成六次軸對稱的圖案，與金表面的晶格對稱性相一致11，且吸附滿足朗格繆爾吸附模型81。研究還發現多肽分子在金表面多肽在金(111)表面的吸附不僅依賴于濃度，而且還是時間依賴的動力學過程。3rGBP1分子在金表面隨著時間由最初的均勻分散單體，到樹枝狀納米結構，最終形成均勻的單層膜，其主要經歷兩個組裝動力學階段15：第一階段，多肽在基底表面形成均勻的單體吸附，并且擴散形成胞核，進而移動合并達到臨界的長度(50－100 nm)，形成延伸的網狀團簇。第二階段，網狀團簇緩慢成熟，并且俘獲剛剛吸附的單體，逐漸占據表面的空隙。之后，網狀團簇逐漸合并，金表面的覆蓋率逐漸增大。并且第二階段的生長速度低于第一階段，主導著多肽薄膜的形成過程。

圖5GO表面的PEG修飾的表征及對GO結合血漿蛋白的影響Fig.5 Characterization of the PEGylation on GO surface,and the effects on GO binding serum proteins

多肽GrBP5是篩選出來的與石墨表面有較強結合力的多肽14，通過AFM觀測其在HOPG表面的結合，發現多肽形成高度為1.4 nm，長度為幾個微米的統一有序自組裝單分子薄膜，其生長方向沿著石墨的晶向，并且形成比較緊湊的折疊結構14。當多肽與HOPG(highly oriented pyrolytic graphite)共孵育10 min時，形成離散的多肽簇。共孵育60 min時，多肽在形成非晶相(AP)和有序相(OP)兩相。當孵育時間達到180 min時，多肽在完全形成有序相(OP)，其高度均為一個多納米。因此，多肽在HOPG表面的組裝可分為兩個階段：(1)多肽在石墨表面的聚集，包括與石墨表面的結合及形成團簇；(2)多肽的密集化及有序組裝過程，伴隨著多肽的相轉變(圖6)。其分子機制如下GrBP5羧基端芳香結構域III包含兩個酪氨酸14，其芳香環能夠通過π－π堆疊50,51與石墨基底產生較強的相互作用。芳香結構域III是多肽GrBP5與石墨表面結合的最初錨定點，是多肽初步聚集階段團簇形成的重要條件。研究證實氨基端疏水域I與中部親水域II形成的兩親片段與HOPG相互作用，再加上多肽分子之間相互作用，為多肽大范圍的有序組裝提供驅動力，使之在HOPG表面更穩定。

通過測量多肽3rGBP1與金表面的結合力及利用高分辨AFM對3rGBP1分子在金表面的組裝表征，從分子層面探究了3rGBP1在金表面的聚集動力學。同樣，通過AFM對多肽GrBP5分子在石墨表面隨時間的組裝結構表征，從分子水平揭示了GrBP5分子在石墨表面的組裝及聚集動力學。

圖6 多肽GrBP5在HOPG表面的組裝過程Fig.6 Assembly process of peptide GrBP5 on HOPG surface

3.2 蛋白質構象的變化

大多數與納米材料相互作用的吸附蛋白質都會發生構象發生變化，其程度與納米材料的表面化學性質有關。帶電或者疏水的納米顆粒比中性電荷或者親水的納米材料更容易導致蛋白質發生較大的構象變化。而蛋白質的結構也對變化的程度有影響。例如，維持蛋白質內部穩定的二硫鍵和鹽橋表現出了出色的抗變形恢復能力82。另外，蛋白質是機體的物質基礎，與生命活動緊密聯系在一起，其構象對于調節某些生理功能至關重要83。納米材料對蛋白質結構及構象的改變也會影響其生物活性及功能。因此，蛋白質基于納米材料界面相互作用產生的構象變化，對其相關的生理功能及疾病的調控也具有重要意義78,84。本課題組基于多肽在HOPG表面的組裝及構象研究，取得了以下進展。

多肽DELERRIRELEARIK在溶液其及晶體中有著穩定的α-螺旋二級結構，并且已被CD光譜和X射線晶體衍射證實85。基于界面間相互作用，本課題組成功地利用HOPG表面對多肽構象進行了調控86。利用STM對多肽在HOPG表面的組裝進行表征，結果顯示多肽的二級結構由α-螺旋轉變為β-折疊，其條隴方向垂直于軸線。利用CD光譜技術檢測多肽溶液在加入石墨顆粒(模擬HOPG)前后二級結構的變化，發現在加入HOPG前，多肽有著穩定的α-螺旋構象。加入石墨顆粒后，溶液出現了β-折疊的典型峰位，證實多肽被誘導成了β-折疊結構(圖7B)。取其離心母液進行測量，β-折疊負峰依然存在。由此證實HOPG能夠誘導多肽二級結構發生β-折疊的轉變，而且轉變之后的構象十分穩定。

人類免疫缺陷1型病毒HIV-1能夠侵染不分裂的細胞87,88，在相關疾病的演化中扮演著重要的角色。而病毒蛋白R(Vpr)89包含96個氨基酸，是HIV-1的附屬蛋白，是病毒前期感染的重要影響因素90－93。Vpr13－33的疏水殘基及其α-螺旋結構是Vpr與細胞蛋白相互作用及調節相關生理功能的重要因素。本課題組基于GO與多肽之間的疏水相互作用83，實現了GO對Vpr13－33生理功能的調控。圓二色譜證實多肽Vpr13－33在溶液中主要形成α-螺旋的二級結構，當加入GO之后，被誘導β-折疊及β-轉角等(圖7E)。通過引入4′4-聯吡啶(4Bpy)，在HOPG表面觀測到Vpr13－33與4Bpy形成共組裝的β-折疊二級結構。AFM觀測結果顯示多肽只能形成細小的原纖維，而在GO的誘導下形成較長的纖維，變得像富含β-折疊的淀粉樣多肽一樣易于聚集。細胞毒性實驗證實，Vpr13－33對成纖維細胞瘤SH-SY5Y及T細胞均有毒性。而在一定范圍內，加入GO之后，可以明顯降低由Vpr13－33誘導的細胞毒性，實現了對其生理功能的調控。

圖7 納米材料誘導的多肽構象的變化Fig.7 Conformation changes of peptides induced by nanomaterials

多肽在HOPG表面沉積并形成β-折疊結構。研究發現，多肽亮度與序列特異性有關94。設計R4G4H8及F4G4H8兩條多肽，包含四種氨基酸(Arg、Gly、His和Phe)。苯丙氨酸Phe可以通過π－π堆疊95,96與HOPG相互作用，帶正電荷的精氨酸Arg可以通過胍基相互作用。通過比對兩條模型多肽在HOPG表面的組裝圖像發現，每條多肽由明暗不同的三段組成。以H8的襯度作為參比歸一化，得到亮度的排序為Phe>His>Arg>Gly。而通過分子模擬(MD)計算得到的氨基酸殘基與HOPG之間的作用能，遵循同樣的順序(圖8)。這項工作闡釋了殘基襯度與其電子能態之間的關系，對研究多肽相關的界面相互作用具有重要的意義。

淀粉樣多肽折疊位點的研究對其聚集動力學及相關抑制劑的探尋具有重要意義。為了探究hIAPP的折疊結構97，引入4Bpy分子，在HOPG表面探究hIAPP8－37與4Bpy分子的共組裝結構。由于4Bpy分子能夠標記和固定多肽分子的C端，測量長度能夠得到hIAPP8－37分子C端的穩定組裝長度。為了得到hIAPP8－37的關鍵折疊位點，引入hIAPP37－8序列，其氨基酸序列與hIAPP8－37完全相同，N端和C端互為顛倒。通過兩端的長度比對，得到其β折疊位點(圖9)，并且與固體核磁XRD和NMR得到的關鍵片段一致。其研究結果對于淀粉樣多肽的復雜折疊結構及形態研究有很大的幫助。

本課題組通過STM對多肽DELERRIRELEARIK及Vpr13－33的高分辨掃描，獲得了其在HOPG表面的精細組裝結構，并且根據CD對多肽二級結構的表征，從分子水平證實了多肽分子在納米材料表面組裝結構的變化；結合STM對多肽R4G4H8及F4G4H8在HOPG表面的組裝結構表征及分子模擬，本課題組從分子水平探究了多肽在HOPG組裝后，其襯度與氨基酸之間的關系；另外，本課題組通過利用STM對多肽hIAPP8－37正反序列組裝結構的表征研究，還獲得了hIAPP8－37分子組裝的關鍵折疊位點。這些工作都從分子水平揭示了多肽分子在材料界面相互作用的結構信息。

圖8 多肽在HOPG表面組裝的STM圖像及分子模擬結果Fig.8 STM images of peptides assemblies on HOPG surface and the molecular simulation results

4 蛋白質對納米材料性能產生的影響

圖9 淀粉樣多肽hIAPP8－37關鍵折疊位點的STM研究Fig.9 STM study of the key folding sites of amyloid hIAPP8－37

圖10 納米材料的多層次異相有序組裝及修飾Fig.10 Multi-level heterogeneous ordered assemblies and the modifications of nanomaterials

納米材料與蛋白質相互作用形成的納米材料-蛋白質復合物會影響納米材料的物理化學性質及其在生物系統中的分布及生物效應，例如納米材料的團聚，等離激元共振的偏移，量子發光效率的改變，生物兼容性的提高及生物毒性的降低等98－102，在人工支架、人工組織等醫療方面得到了很好的應用。利用蛋白質或多肽在納米材料表面的組裝可以優化納米材料的合成103，實現納米材料的功能化修飾。通過基因技術篩選出與金屬(Pt、Au、Ag)，氧化物(ZnO、Cu2O、CaCO3)，半導體(CdS、ZnS、GaAs)及其他基底具有親和力的基因工程多肽(GEPIs)14,43,80,104。這些多肽在納米科技領域最主要的應用是作為無機材料的組裝及連接分子對納米材料表面功能化修飾，或者通過與材料表面的識別與組裝介導材料形成多功能有序的異質組裝結構，是納米材料組裝、生長及表面功能化很好的模板(圖10)。通過多肽分子將納米材料靶向到其他表面可形成多層次納米結構，實現腫瘤的探測。另外，通過引入另一條多肽還可實現兩種材料的結合。如多肽AuBP1和QBP1可以分別識別金表面及硅表面，多功能多肽AuBP1-QBP1可以實現金納米顆粒在硅表面的修飾105。基于生物分子識別機制，還可以引入量子點從而實現表面等離子激元增強熒光。通過引入具有π共軛電子的材料識別多肽，可以實現生物材料與電子元件之間的連接和電子傳輸，在生物傳感及疾病診斷有所應用106。與羥磷灰石(HA)具有高親和力的多肽HABP1在溶液中的組裝可以調控磷酸鈣的形成107及晶體形貌，實現特定組織的修復及重生等108。基于與蛋白質界面間相互作用的材料制備109，為納米材料在微電子、納米科技及生物醫學等各個領域的應用開辟了新的途徑。

5 總結與展望

蛋白質/多肽分子與納米材料界面之間相互作用的研究涉及眾多領域，有著重要的科學價值。但是其相互作用的分子機制還有待于深入研究。另外一方面，隨著化妝品、醫藥、食品及洗護用品等納米材料產品的大量生產，其不僅給社會及生活帶來了便利，同時也帶來了挑戰。納米材料在使用及食用過程中不可避免進入人體。我們在發掘其潛力的同時必須認識到其可能的安全隱患，包括其在生體內的代謝途徑、細胞毒性及環境污染等。納米材料的安全性是社會各界關心的重要問題，其評估是一個不可逃避的科學問題，也是一個社會及倫理學問題。納米材料安全性評估急需臨床及醫學調查及毒性評價標準化。總之，人類應該高度重視納米材料的潛在風險，推動其理性使用，從而服務人類，造福人類。

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Molecular Mechanisms of Interface Interactions between Nanomaterials and Proteins

HOU Jing-Fei YANG Yan-Lian*WANG Chen*
(National Center for Nanoscience and Technology,CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety,CAS Key Laboratory of Standardization and Measurement for Nanotechnology,CAS Center for Excellence in Nanoscience,Beijing 100190,P.R.China)

Nanomaterials have excellent properties and have been used widely in chemical engineering, electronics,mechanics,environment,energy,aerospace,and many other fields in recent years.Besides, nanomaterials have attracted increasing attention in the biomedical field.The interactions between nanomaterials and protein molecules are not only significant to the basic science of the biomedical field,but also crucial for the evaluation of biomedical applications and biosafety of nanomaterials.The interfacial interactions between proteins and nanomaterials could induce a series of changes to the structures and functions of proteins,such as the transformation of protein conformations,and the modulation of aggregation states,which would influence the functions of the protein molecules.Interfacial interactions can also influence the physicochemical features of nanomaterials,including morphology,size,hydrophilicity/hydrophobicity,and surface charge density.In this review we explained the molecular level mechanisms for the interactions between nanomaterials and proteins at the interface based on the detection technologies,and discussed the changes in physical and chemical features,structures,and functions.We envision this review could be helpful for the deeper understanding of the complicated interactions between nanomaterials and proteins,and could be beneficial for promoting the healthy,safe,and sustainable development and application of nanomaterials in the biological and medical fields.

Nanomaterial;Protein;Interface;Interaction;Biological and medical application; Molecular mechanism

O647

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10.3866/PKU.WHXB201608233www.whxb.pku.edu.cn

Received:June 1,2016;Revised:August 22,2016;Published online:August 23,2016.

*Corresponding authors.YANG Yan-Lian,Email:yangyl@nanoctr.cn;Tel:+86-10-82545559.WANG Chen,Email:wangch@nanoctr.cn; Tel:+86-10-82545561.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21273051).

國家自然科學基金(21273051)資助項目?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica