某肉雞場(chǎng)新城疫、H9亞型禽流感、傳染性支氣管炎感染狀況調(diào)查*

劉敬，孫博，蘇曉彤，燕國(guó)麗，張蓓，劉丹，朱明霞

（山東聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059）

某肉雞場(chǎng)新城疫、H9亞型禽流感、傳染性支氣管炎感染狀況調(diào)查*

劉敬，孫博，蘇曉彤，燕國(guó)麗，張蓓，劉丹，朱明霞**

（山東聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059）

為了解肉雞新城疫、H9亞型禽流感、雞傳染性支氣管炎的感染狀況，從山東省某肉雞場(chǎng)采集組織樣品120份，采用雞胚尿囊腔傳代接種法分離病毒，并利用血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)和RT-PCR試驗(yàn)對(duì)分離毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：各周齡ND的檢出率：2號(hào)舍均為41.67%，4號(hào)舍分別為33.33%、25%、33.33%、41.67%和33.33%；各周齡H9的檢出率：2號(hào)舍分別為41.67%、50%、33.33%、58.33%和41.67%，4號(hào)舍分別為50%、25%、50%、58.33%和50%；各周齡IB的檢出率：2號(hào)舍均未檢出，4號(hào)舍19日齡IB的檢出率為8.33%。該結(jié)果為規(guī)模化肉雞場(chǎng)有效預(yù)防和控制這3種主要疫病提供了科學(xué)依據(jù)。

肉雞；新城疫；H9亞型禽流感；雞傳染性支氣管炎；感染狀況調(diào)查

隨著肉雞業(yè)的迅速發(fā)展，規(guī)模化飼養(yǎng)程度的不斷提高，飼養(yǎng)密度及單舍飼養(yǎng)量的增加，呼吸道疾病的危害日趨嚴(yán)重，而引起呼吸道疾病的病因也非常復(fù)雜，有病原因素（病毒、細(xì)菌、支原體等）、飼養(yǎng)管理因素、環(huán)境衛(wèi)生因素、應(yīng)激因素、中毒因素等，屬多因素疾病。在病原因素中尤以禽流感（H9亞型）、新城疫和雞傳染性支氣管炎對(duì)肉雞造成的危害最為普遍[1]。Lewis等[2]研究發(fā)現(xiàn)在目前普遍采用疫苗免疫的情況下，ND在部分地區(qū)流行依然嚴(yán)重，且表現(xiàn)出新的流行病學(xué)特點(diǎn)，如高免雞群發(fā)病等。于康震等[3]對(duì)部分地區(qū)商品蛋雞及養(yǎng)雞專業(yè)村禽流感血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)H9亞型陽(yáng)性雞群占禽流感陽(yáng)性雞群總數(shù)的93.7%，證實(shí)禽流感、尤其是中等毒力以下 H9亞型禽流感在中國(guó)的廣泛存在，是目前影響中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要禽流感病毒亞型。2009年徐守振等[4]用RT-PCR技術(shù)對(duì)山東膠東地區(qū)送檢患有呼吸道癥狀的病料進(jìn)行感染情況調(diào)查，其結(jié)果表明該地區(qū)NDV、IBV和AIV(H9)的感染情況比較普遍，且存在一定程度的混合感染。本試驗(yàn)選用山東某規(guī)模化肉雞場(chǎng)的2個(gè)雞舍進(jìn)行全程跟蹤，對(duì)2個(gè)舍整個(gè)飼養(yǎng)期內(nèi)的死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)死亡雞的病料及時(shí)采集、分離，調(diào)查其死亡原因；該研究結(jié)果為該集團(tuán)規(guī)模化肉雞場(chǎng)有效控制肉雞呼吸道病的發(fā)生和流行提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 120只不同日齡的試驗(yàn)雞只樣品，采自山東省某規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖集團(tuán)公司；9日齡SPF雞胚購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。

1.2 試劑 Trizol試劑購(gòu)自 Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷 （Tris）、EDTA、瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 病料的處理 無(wú)菌采取試驗(yàn)雞只的肺臟，分別在滅菌的乳缽內(nèi)充分研磨，用滅菌生理鹽水制成1:3乳劑，4℃條件下5000r/min離心5min，取上清液，加入2000IU/ml青霉素、鏈霉素。反復(fù)凍融3次，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 雞胚接種 上述病料經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚，0.2m1/枚，另設(shè)陰性對(duì)照。棄除24h內(nèi)死亡胚，觀察3～5d，每天記錄結(jié)果，收取 24h后死亡胚的尿囊液，于-80℃冷凍保存、備用。

1.3.3 病毒RNA的提取 250μl雞胚尿囊液中加入750μl Trizol，劇烈震蕩1min，室溫靜置5min；向上述體系中加入300μl氯仿，劇烈振蕩1min，室溫靜置 3min；12000r/min，4℃離心15min；取上清（約500μl）置于一個(gè)新的DEPC處理過(guò)的1.5ml離心管中，加入 500μl異丙醇，混勻后室溫沉淀30min；12000r/min，4℃離心15min；棄上清，加入1 ml75%乙醇洗滌RNA沉淀物，12000r/min，4℃離心10min；棄上清，室溫空干后加入30μl DEPC水溶解沉淀。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè) 根據(jù)Gen bank已發(fā)布的 H9N2AIV、NDV和 IBV的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性引物（表1），分別用于檢測(cè)。引物由上海生工公司合成。

表1 引物序列

1.5 RT-PCR反應(yīng) 用提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：采用10μl反轉(zhuǎn)錄體系（表2、表3），具體操作及條件如下：

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

表3 反轉(zhuǎn)錄體系

1.5.1 Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl。

1.5.2 70℃保溫10min后迅速在冰上急冷2min以上。

1.5.3 離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部。

1.5.4 在上述 Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。

1.5.5 42℃保溫1h。

1.5.6 70℃保溫15min后冰上冷卻，得到的cDNA。

用制備的cDNA進(jìn)行PCR：采用25μl PCR體系（表4），反應(yīng)條件如下：經(jīng) 94℃5min變性，然后94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，72℃ 10min延伸。

表4 PCR體系

反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 2號(hào)舍病原檢測(cè)結(jié)果 見表5。

表5 2號(hào)舍病原檢測(cè)結(jié)果

由表5可知：2號(hào)舍5、12、19、26日齡和33日齡ND的檢出率均為41.67%，H9的檢出率分別為41.67%、50%、33.33%、58.33%和41.67%，各周齡均未檢出IB。

2.2 4號(hào)舍試驗(yàn)期疾病監(jiān)測(cè)結(jié)果 見表6。

表6 4號(hào)舍病原檢測(cè)結(jié)果

由表6可知：4號(hào)舍5、12、19、26日齡和33日齡 ND的檢出率分別為 33.33%、25%、33.33%、41.67%和33.33%；H9的檢出率分別為50%、25%、50%、58.33%和 50%；19日齡 IB的檢出率為8.33%。

2.3 樣品中3種病原PCR凝膠電泳部分結(jié)果見圖1。

圖1 樣品中3種病原PCR凝膠電泳部分結(jié)果

3 討論

3.1 2個(gè)試驗(yàn)舍NDV各周齡的檢出率均較高，而NDV檢出率高不能排除疫苗毒感染，要想確定是疫苗毒感染還是野毒感染需進(jìn)一步擴(kuò)毒鑒定。

3.2 IBV檢出率較低：因本次試驗(yàn)是只對(duì)病料處理后進(jìn)行PCR的鑒定，要進(jìn)一步鑒定是否存在IBV感染，仍需接種雞胚擴(kuò)毒。

3.3 2個(gè)試驗(yàn)舍H9亞型AIV各周齡的檢出率均較高，而鑒于前期試驗(yàn)中弱、死胚中的H9檢出率極低，所以肉雞后期H9亞型AIV的感染可能主要源于環(huán)境污染或雞苗污染帶毒。

4 結(jié)論

眾所周知：肉雞呼吸道疾病是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外肉雞的常見疾病，常造成肉雞養(yǎng)殖的嚴(yán)重?fù)p失，死淘率可達(dá)30%以上，并造成發(fā)病雞生長(zhǎng)遲緩、胴體降級(jí)或廢棄[5,6]。 肉雞呼吸道病病因極為復(fù)雜[7-9]，而新城疫病毒(NDV)、H9亞型AIV、傳染性支氣管炎病毒（IBV）被證明是引起肉雞呼吸道疾病的主要致病因素。本次試驗(yàn)結(jié)果表明：在對(duì)兩個(gè)雞舍全程跟蹤調(diào)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，NDV和H9亞型AIV各周齡的檢出率均較高，證明在規(guī)模化肉雞場(chǎng)二者是普遍存在的，而H9亞型AIV素有肉雞“萬(wàn)病之源”之稱[10]。2個(gè)試驗(yàn)舍雖然只發(fā)生 1例 IB感染，但并不排除IB的存在。鑒于本次感染狀況調(diào)查結(jié)果，對(duì)規(guī)模化肉雞場(chǎng)而言應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)NDV、H9亞型AIV和IBV的抗體監(jiān)測(cè)，規(guī)范易感日齡雞群的飼養(yǎng)管理、制定合理免疫程序、改善環(huán)境衛(wèi)生、減少這三種疫病給規(guī)模化肉雞場(chǎng)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

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Infectional investigations of H9subtype Avian Influenza,Newcastle Disease and Infection Bronchitis in one broiler breeder flocks

LIU Jing,SUN Bo,SU Xiao-tong,YAN Guo-li,ZHANG Bei,LIU Dan,ZHU Ming-xia*
(Agricultural college of Liaocheng university,ShanDong LiaoCheng 252059)

In order to investigate the infection of Newcastle Disease,H9Subtype Avian Influenza and Infection Bronchitis and in one Broiler Breeder Flocks.120 share tissues were collected from the diseased chicken in one broiler breeder flocks of Shandong Province.The viruses that isolated by embryonated egg-culture,meanwhile,the viruses was identified by Hemagglutination test(HA), Hemagglutination Inhibition test(HI)and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). The results showed that:the positive rates of NDV every week were all 41.67%in the second chicken house,the fourth chicken house were respectively 33.33%,25%,33.33%,41.67% and 33.33%.The positive rates of AIV(H9)every week were respectively 41.67%,50%,33.33%,58.33%and 41.67%%in the second chicken house,the fourth chicken house were respectively 50%,25%,50%, 58.33%and 50%.The positive rates of IBV every week were zero in the second chicken house,the fourth chicken house was 8.33% in the nineteenth day.These results would offer the scientific evidence to prevent and control these diseases in broiler breeder flocks.

Broiler;Newcastle Disease;H9Subtype Avian Influenza;Infection Bronchitis; Infectional Investigation

S858.311.31+3

B

1673-1085（2017）01-0041-04

2016-12-13

1.2015國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201510447052）；2.山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（J14LF03）。

劉敬（1993-），動(dòng)物科學(xué)本科在校生。

**通訊作者：朱明霞（1978-），女，山東茌平人，副教授，博士后，研究方向：動(dòng)物抗病育種與疫病防控；Email：1538054669@qq.com。