特色馬鈴薯品種紅寶石再生系統(tǒng)的篩選

黃萍+馬朝宏+顏謙

摘 要：采用3因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以特色馬鈴薯品種紅寶石試管苗莖段為試材，分別選用3種植物激素（誘導(dǎo)愈傷用NAA，2，4-D，6-BA；誘導(dǎo)分化用NAA，GA3，6-BA）的3個(gè)水平對(duì)其莖段的離體再生進(jìn)行研究，篩選適合紅寶石的愈傷和芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基表現(xiàn)出不同的誘導(dǎo)效果，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+NAA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1，愈傷率達(dá)100%；植株再生最佳培養(yǎng)基是MS+NAA 0.5 mg·L-1+GA3 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1，再生率為80.3%，分化后再生苗健壯。

關(guān)鍵詞：特色馬鈴薯；愈傷組織；誘導(dǎo)；分化

中圖分類號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.02.004

Abstract： L9（34）orthogonal design was adopted to select the optimal plant hormone combination for regeneration of ‘Hongbaoshi potato stem. Three plant hormones（callus induction with NAA、2，4-D、6-BA and bud differentiation with NAA、GA3、6-BA） were applied at three different levels to study their influences on the growth and differentiation of potato stem. The results indicated that the optimal medium for callus induction from stem was the 6 number medium （MS+NAA0.5 mg·L-1+2.4-D1.0 mg·L-1+6-BA0.5 mg·L-1）， with 100% induction percentage. The optimal medium for inducing bud differentiation from stem callus were the number 8 medium （MS+NAA0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+6-BA1.0 mg·L-1）， with 80.3% induction percentage of adventitious buds and strong seedling.

Key words： potato；callus；induction；differentiation

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移，從而改良經(jīng)濟(jì)性狀，使馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)日益豐富，產(chǎn)量和品質(zhì)不斷得到提高[1-4]。而無(wú)論是基因轉(zhuǎn)化，還是轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量的增加，都依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立，受體系統(tǒng)的建立則主要依賴于植物組織培養(yǎng)的再生環(huán)節(jié)，即建立高效的馬鈴薯離體再生體系。許多研究表明，再生系統(tǒng)易受基因型、外植體種類、植物激素種類及濃度、培養(yǎng)條件和操作水平等諸多因素的影響[5-11]。因此，對(duì)特定品種、特定材料進(jìn)行再生系統(tǒng)篩選，以確定有針對(duì)性的最佳培養(yǎng)基配方非常必要。

紅寶石是一個(gè)皮肉皆是紅色的彩色馬鈴薯特色品種，因其外形美觀、品質(zhì)好（適合烤、蒸、煮、炸、炒，且色澤不變）、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高（比普通馬鈴薯豐富）、商品附加值高、適用性強(qiáng)而備受青睞，具廣泛的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)特色馬鈴薯品種紅寶石的莖段離體培養(yǎng)和再生進(jìn)行初報(bào)，以期為其基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以特色馬鈴薯品種紅寶石脫毒試管苗莖段為材料，由貴州省馬鈴薯研究所組培室莖尖脫毒培養(yǎng)構(gòu)建而成。

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基配制 以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，添加不同激素配制成愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體設(shè)計(jì)采用3因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)（表1），NAA質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 mg·L-1；2，4-D質(zhì)量濃度為0，0.5，1 mg·L-1；6-BA質(zhì)量濃度為0.5，1，2 mg·L-1。

以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，添加不同激素配制成分化培養(yǎng)基，具體設(shè)計(jì)采用3因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)（表1），NAA質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.5 mg·L-1；GA3質(zhì)量濃度為0，1，2 mg·L-1；6-BA質(zhì)量濃度為1，2，3 mg·L-1。

1.2.2 接種試管苗莖段 將培養(yǎng)25～30 d的供試材料試管苗置于超凈工作臺(tái)上，剪取長(zhǎng)約0.5～1.0 cm、不帶腋芽莖段平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，接種15瓶，每瓶5個(gè)莖段。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)溫度（22±2） ℃，黑暗培養(yǎng)5～8 d后進(jìn)行16 h·d-1光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 lx。40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷組織顏色、形狀、生長(zhǎng)量。

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種莖段數(shù)×100%

1.2.4 愈傷組織分化 將愈傷組織取出接種在分化培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度（22±2） ℃，16 h·d-1光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。50 d后統(tǒng)計(jì)芽分化率。

芽分化率=分化出芽的愈傷組織數(shù)/總愈傷組織數(shù)×100%

平均芽數(shù)=總芽數(shù)/出芽愈傷數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段愈傷組織誘導(dǎo)情況

莖段接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，切面漸漸褐化，7 d左右兩端開始膨大變粗，逐漸擴(kuò)展到中間，約20 d切口處長(zhǎng)出肉眼可見的愈傷組織。

由表3可知， 9種激素組合均能使供試材料誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷的誘導(dǎo)率差異較大，最高可達(dá)100%，最低只有40.3%。愈傷組織形狀多為啞鈴狀、表面光滑、粗糙或布滿細(xì)小顆粒，結(jié)構(gòu)有致密和疏松兩種類型，顏色主要淺紫紅、淺紫紅帶綠、淺紫紅帶褐、深紫紅色。馬鈴薯品種紅寶石莖段在各種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織在質(zhì)地、大小、顏色和生長(zhǎng)速度等方面存在很大差異，莖段在2，6，7，8號(hào)處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%，但在4種培養(yǎng)基上形成愈傷的量不同，其中6號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織的生長(zhǎng)量最高，且結(jié)構(gòu)致密，適合誘導(dǎo)芽。2，7號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基上形成的愈傷組織量差異不明顯，但在質(zhì)地和顏色上存在差異，三者相比之下2號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基激素組合更優(yōu)于7號(hào)。9號(hào)培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率最低，只有40.3%，呈深紫紅色，質(zhì)地疏松且呈水浸狀，不利于芽的誘導(dǎo)。1，3號(hào)培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率高于80%，但愈傷量低。4，5號(hào)培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率90%以上，但愈傷量和質(zhì)地上存在差異。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果分析，6號(hào)培養(yǎng)基最利于紅寶石誘導(dǎo)愈傷組織，在后期愈傷組織再生培養(yǎng)中可選擇該培養(yǎng)基作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 愈傷組織不定芽分化

愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其顏色逐漸加深，致密程度加強(qiáng)，30 d左右，部分培養(yǎng)基上的愈傷組織開始萌發(fā)芽點(diǎn)，逐漸生長(zhǎng)成小苗。由表4可知，不同培養(yǎng)基對(duì)莖段愈傷組織不定芽分化的影響不同，芽分化率最高可達(dá)84.6%，而在未添加GA3的培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率均為0。在所試9種培養(yǎng)基中，除1、4和7號(hào)培養(yǎng)基外，其余6種培養(yǎng)基上的愈傷組織平均出芽數(shù)均超過(guò)2個(gè)，9號(hào)培養(yǎng)基上的平均出芽數(shù)最高，為6.9個(gè)，但苗細(xì)弱、淡黃綠色，不利繼代培養(yǎng)；8號(hào)培養(yǎng)基上的出芽數(shù)次之（4.8個(gè)），5號(hào)培養(yǎng)基上出芽數(shù)第3（4.2個(gè)）。從芽分化率和不定芽長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，誘導(dǎo)莖段愈傷不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為8號(hào)培養(yǎng)基。

3 討 論

植物激素是植物細(xì)胞、組織、器官離體培養(yǎng)必不可少的物質(zhì)，培養(yǎng)基中激素的組配和濃度非常重要，馬鈴薯的愈傷誘導(dǎo)和芽分化的激素組合因不同的品種、外植體差異很大。韓善華等[12]用6-BA 2.0 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1從莖段愈傷組織再生了植株，誘導(dǎo)率為50%；葉彥等[13]用6-BA 2.0 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基也得到了再生植株，但誘導(dǎo)率很低，只有5%；李娟等[14]用6-BA 2.0 mg·L-1，NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖段愈傷組織卻得到了高達(dá)96.7%的再生植株誘導(dǎo)率。齊恩芳等、盧翠華[15] 、李娟等[16]研究結(jié)果表明，對(duì)芽分化促進(jìn)作用最大的是6-BA，不含6-BA的處理愈傷易生根，不易分化出芽。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA3對(duì)芽分化和伸長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，在沒添加GA3的培養(yǎng)基中無(wú)芽形成，調(diào)整GA3濃度是提高分化效果的關(guān)鍵因素，這與葉彥[13]、李鳳云等[8]研究結(jié)果相符。由此可見，一種或幾種培養(yǎng)基并不能適應(yīng)所用的品種，因此，針對(duì)不同基因型選擇誘導(dǎo)再生激素類型和濃度十分必要。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳錚，金紅，羅智敏.提高馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系再生頻率的研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，8（4）：4-6.

[2]王萍，王罡，季靜.馬鈴薯兩個(gè)基因型不同外植體的組織培養(yǎng)與植株再生[J].中國(guó)馬鈴薯，2006，20（6）：326-328.

[3]王永鋒，欒雨時(shí).馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)馬鈴薯，2004，18（4）：227-231.

[4]李晶.馬鈴薯再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5]陳愛芹，艾辛.紫外線輻照對(duì)馬鈴薯莖段愈傷組織及其再生植株的影響[J].長(zhǎng)江蔬菜，2010 （22）：12-16.

[6]齊恩芳，張金文，王一航.馬鈴薯莖段再生的植物激素配比優(yōu)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（6）：14-17.

[7]楊瓊芬，白建明，李先平，等.彩色馬鈴薯葉片再生體系的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19（S1）：83-88.

[8]李鳳云，盛萬(wàn)民，于天峰，等.馬鈴薯不同品種莖段再生系統(tǒng)的篩選[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（8）：99-100， 113.

[9]董穎蘋，黃萍，顏謙，等.幾個(gè)馬鈴薯栽培種的莖段愈傷組織誘導(dǎo)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（5）：24-26.

[10]羅源，陳耀鋒，李春蓮，等.馬鈴薯莖段愈傷組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，35（10）：159-162.

[11]黃雪麗，潘慶明，倪蘇，等.PP333對(duì)馬鈴薯試管葉片與莖段愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響[J].中國(guó)馬鈴薯，2009，23（2）：87-89.

[12] 韓善華，鄭國(guó)锠.馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）幼莖（芽）愈傷組織培的誘導(dǎo)和植株再生（簡(jiǎn)報(bào)）[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1982（1）：113-119.

[13]葉彥，繆樹華.長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)馬鈴薯愈傷組織的植株再生[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1995，1（1）：26-33.

[14]李娟，程智慧，張國(guó)裕.四個(gè)馬鈴薯品種幼莖段再生技術(shù)的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（3）：122-126.

[15]盧翠華，秦昕，武小霞，等.馬鈴薯極早熟品種東農(nóng)303再生系統(tǒng)的篩選[J].中國(guó)馬鈴薯，2001（5）：280-281.

[16]李娟，程智慧，張國(guó)裕.馬鈴薯葉片高效再生體系的建立[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（4）：610-614.