楊梅素體外作用于人肝癌HepG—2細胞的研究

黃清玲++李宏偉

摘 要：目的：主要考察研究楊梅素（Myricetin）對人肝癌細胞株HepG-2增殖的影響。 方法：主要通過MTT比色法，觀察24 h，48 h，72 h不同濃度楊梅素作用HepG-2后細胞的生長情況，確定最佳作用時間；通過MTT、SRB法觀察楊梅素作用于人肝癌HepG-2細胞72h后的影響，考察楊梅素對HepG-2細胞增殖的影響。結(jié)果：人肝癌細胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理作用72h的生長抑制最明顯，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，其IC50值為207.99 μmol·L-1。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。結(jié)論：結(jié)果表明楊梅素可抑制HepG-2細胞增殖，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：楊梅素；人肝癌細胞HepG-2；MTT；SRB

楊梅素（myricetin.Myr），是一種黃酮類化合物，有報道表明楊梅素具有降低神經(jīng)毒性，影響淋巴細胞活化及增殖，拮抗血小板活化因子（PAF），降血糖，抗氧化和保肝護肝等多種生物學(xué)功能。Ching-Huai Ko等[1]人研究表明楊梅素對結(jié)腸直腸癌中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP）的表達和活性有抑制作用，通過影響蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化和c-Jun的表達誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細胞凋亡。對胰腺癌細胞信號傳導(dǎo)途徑PI3K/ATK有阻滯作用[2-4]。以上資料證明楊梅素是一種有效的致癌作用化學(xué)防治劑。本文以HepG-2細胞系為研究對象，利用SRB法和MTT比色法對供試藥物楊梅素行體外抑制活性考察，并用SPSS15.0對兩種篩選方法得到的實驗結(jié)果進行差異性分析。以期探明抗楊梅素體外篩選中SRB法和MTT比色法實驗結(jié)果的相互驗證作用，實現(xiàn)楊梅素體外篩選結(jié)果的準確可靠[5-6]。

1.實驗材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株

人肝癌細胞（HepG-2）由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研工作站傳代保種。

1.1.2細胞培養(yǎng)

實驗所用細胞在含5%CO2的37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，每周傳代兩次。

1.2試驗方法

1.2.1.MTT法測定楊梅素對人肝癌HepG-2細胞增殖的影響

實驗步驟：

將對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后配制成濃度為5×104細胞/ml的細胞液；按5000個/孔接種于96孔板，每孔加100 μl，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h；次日加入含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μl（DMSO終濃度<0.5%），每藥設(shè)6個劑量組，阿霉素（ADM）17 μmol·L-1作為陽性對照組，每組6個平行孔。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72h。棄上清，用培養(yǎng)液洗3次，以去除藥液。每孔加100 μl新鮮配制的含0.5 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄培養(yǎng)上清，每孔加200 μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻。用MK3型酶標儀在參考波長490 nm，檢測波長570 nm條件下測定光密度值（OD），以溶劑對照處理的腫瘤細胞為對照組，用下面公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并按中效方程計算IC50：

1.2.2.SRB法測定楊梅素對人肝癌HepG-2細胞增殖的影響

基本原理：

Suforhodamine B（SRB）是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，其顏色變化與活細胞蛋白呈正比。同時，其在515nm的OD值與細胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系，故可用作細胞數(shù)的定量。

實驗步驟：

將對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后配制成濃度為2×104細胞/ml的細胞液，按1000個/孔接種于96孔板，每孔加100 μl。培養(yǎng)24小時后加入待測藥物，同時測定此時細胞的OD515值（T0）。加藥72小時后進行測定：每孔加預(yù)冷的50%三氯乙酸（TCA）液50 μl固定（TCA終濃度10%），靜置5分鐘，將96孔板移至4℃放置1小時；倒掉固定液，去離子水洗5遍，空氣干燥后，每孔加SRB液100 μl（用1%醋酸配成4mg/ml溶液），室溫放置10分鐘；1%醋酸洗5遍，空氣干燥后，加150 μl 10mmol/L非緩沖Tris堿液（pH10.5）溶解，穩(wěn)定10 min后測定OD515 nm值。按中效方程計算細胞50%生長抑制所需的藥物濃度（GI50）；細胞完全生長抑制所需的濃度（TGI）；殺死50%細胞所需藥物濃度（LC50）。

統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K法。所有實驗結(jié)果采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果與討論

2.1.MTT實驗結(jié)果與分析

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物（formazan）并沉積于細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的紫色結(jié)晶物，用酶標儀檢測在560 nm波長處光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。用MTT法觀察了楊梅素對體外培養(yǎng)的HepG-2細胞生長的影響。從實驗結(jié)果能夠看出人肝癌細胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理24 h，48 h，72 h后，細胞生長明顯受到抑制，隨著給藥時間和給藥劑量的增加，細胞生長抑制率逐漸增大，72 h作用最明顯。說明楊梅素對HepG-2細胞有明顯的生長抑制作用，并且具有良好的時間劑量依賴關(guān)系。各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。其IC50值為207.99 μmol·L-1。

2.2.SRB實驗結(jié)果與分析

經(jīng)過SRB法檢測，不同濃度楊梅素作用細胞72h后，細胞生長受到抑制，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

3.結(jié)論

3.1.MTT法結(jié)果表明，經(jīng)過楊梅素處理24 h，48 h，72 h的人肝癌細胞HepG-2生長受到抑制，隨著給藥時間和藥物濃度增加，抑制率均有升高的趨勢。經(jīng)過比較，人肝癌細胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理作用72 h的生長抑制最明顯，因此，將人肝癌細胞HepG-2作用時間定為72 h。

3.2.MTT法觀察了楊梅素對體外培養(yǎng)的HepG-2細胞生長的影響。實驗結(jié)果顯示不同濃度楊梅素作用細胞72 h后，細胞生長受到抑制。并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。其IC50值為207.99 μmol·L-1。

3.3.SRB法結(jié)果表明不同濃度楊梅素作用細胞72 h后，細胞生長受到抑制，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

參考文獻

[1]Ching-Huai Ko，Shing-Chuan Shen，Tony J.F.Lee， et al.Myricetin inhibits matrix metalloproteinase 2 protein expression and enzyme activity incolorectal carcinoma cells.Molecular cancer therapeutics. 2005，4：281～290.

[2] 徐春華. MTT法檢測大豆異黃酮對癌細胞的生長抑制作用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）. 2012（01）.

[3] 銀久，宋寶安，金林紅，胡德禹，楊松，李寧，吳守偉. SRB法和MTT法抗腫瘤藥物篩選結(jié)果相關(guān)性研究[J]. 生物學(xué)雜志. 2009（04）.

[4] 莊金秋，梅建國，楊麗梅，莫玲，沈志強. MTT法細胞計數(shù)中細胞接種量的確定[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技. 2016（03）.

[5] 王英婷， 楊旭東，黃燮南.利用中效原理觀察紫杉醇和木黃酮對子宮內(nèi)膜癌JEC細胞的作用.腫瘤學(xué)雜志. 2011，02.

[6] 朱勝章，陸建波. 腫瘤細胞原代培養(yǎng)的應(yīng)用與發(fā)展[J]. 腫瘤基礎(chǔ)與臨床. 2012（01）.