千里香植物組織培養(yǎng)的優(yōu)化

徐紅紅++潘永玖++梁麗敏++李珊珊

摘 要：千里香為我國較常見的藥用植物，有麻醉止痛，消腫解毒等功效。本實(shí)驗(yàn)以其新生幼葉及莖段為外植體，通過優(yōu)化組織培養(yǎng)方法，篩選出適宜千里香生長的培養(yǎng)基體系，其中生長素的種類及含量對(duì)外植體的生長具有重要作用，同時(shí)，一定濃度的活性炭也可以有效地預(yù)防愈傷組織的褐化。經(jīng)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適合千里香生長的培養(yǎng)基為：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次實(shí)驗(yàn)旨在為千里香的無土大面積栽培提供新的方法和途徑，同時(shí)也為千里香在分子水平的研究提供無菌材料。

關(guān)鍵詞：千里香；組織培養(yǎng)；優(yōu)化；生長素

基金項(xiàng)目：廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族醫(yī)學(xué)院校級(jí)課題。

千里香（Murraya paniculata）又名七里香、萬里香，為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物，原名小葉九里香，1978年黃成就將小葉九里香上升為種，更名為千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而廣泛分布于我國的廣西、云南等高海拔溫?zé)岢睗竦貐^(qū)，植物體為常綠灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多種功效，是我國較常用的中草藥材。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)千里香的研究較少，且多見于對(duì)其化學(xué)組份以及藥理作用的探索，D.P. Chakraborty等人發(fā)現(xiàn)千里香植物體內(nèi)含有一種新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人從千里香的葉子中提取了兩種氧甲基黃酮，具有抗菌消炎作用[3]；閆江紅等人利用HPLC法對(duì)千里香葉片中黃酮類成分含量進(jìn)行了測定[4]。人們對(duì)該材料進(jìn)行藥理分析的同時(shí)，對(duì)其組織培養(yǎng)方面以及分子蛋白水平的研究甚少，國內(nèi)外暫時(shí)還沒有千里香植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)，通過本次實(shí)驗(yàn)，旨在為千里香進(jìn)一步的分子水平以及蛋白水平研究提供無菌材料，提高其實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和成功率，同時(shí)，也為植物組織培養(yǎng)技術(shù)提供新的方法和途徑。

1材料采集

于2016年8月選擇晴朗天氣在廣西省百色市境內(nèi)進(jìn)行材料的采集，選擇生長健壯、污染較少、無病害的千里香植株，采摘帶腋芽的莖段、帶小葉柄的葉軸以及幼葉作為培養(yǎng)材料。

2方法

2.1外植體處理

將采集的實(shí)驗(yàn)材料用無菌水沖洗8min。其中帶葉小柄的葉軸和帶腋芽的莖段分割成長約1cm的莖段，嫩葉邊緣全部剪掉，以便愈傷組織的生長，留下葉子的中心部分，約占原有葉子面積的一半以上。

2.2外植體消毒

將預(yù)處理好的外植體放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速轉(zhuǎn)入10%的次氯酸鈉溶液消毒3min，然后用無菌水沖洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用無菌水沖洗5次，最后將消毒后的外植體放在無菌濾紙上吸干表面水分后接種在胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2.3培養(yǎng)基配置

誘導(dǎo)芽生長培養(yǎng)基

MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

增殖培養(yǎng)基

（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

2.4愈傷組織培養(yǎng)

初代外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度為26℃，光照16h，黑暗8h，光強(qiáng)為2500lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察和記錄外植體的生長及變化。

2.5 6-BA濃度梯度試驗(yàn)

將長勢一致、誘導(dǎo)良好的外植體分別轉(zhuǎn)入不同濃度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培養(yǎng)基（1）中培養(yǎng)，每濃度試驗(yàn)10瓶，培養(yǎng)30d。

2.6活性炭試驗(yàn)

將誘導(dǎo)良好的外植體分別移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培養(yǎng)基中（2、3增殖培養(yǎng)基），進(jìn)行抑制褐化實(shí)驗(yàn)，每種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)10瓶，培養(yǎng)15d，觀察有無活性炭對(duì)外植體褐化影響。

2.7生長素種類試驗(yàn)

挑選長勢好的材料放入含有一定濃度的IBA生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（4），每種接種10瓶，周期30d，與其他生長素進(jìn)行對(duì)比。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織的影響

6-BA為植物組織培養(yǎng)常用的細(xì)胞分裂素，可以有效促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分裂，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)植物在組織培養(yǎng)過程中，該生長素的使用含量差異較大，例如林茜等人對(duì)四數(shù)九里香植物組織進(jìn)行培養(yǎng)過程中[5]，6-BA增長濃度為1.0mg/L。王小敏等人在兩面針的組織培養(yǎng)與快速繁殖中[6]，6--BA的增長濃度為2.0mg/L，因而本實(shí)驗(yàn)利用不同的濃度梯度培養(yǎng)，最終篩選出最適宜千里香生長的6-BA濃度為2.5mg/L。由表1可知，當(dāng)外植處于不同濃度的6-BA培養(yǎng)基時(shí)，外植體均可長出愈傷組織，而當(dāng)6-BA濃度為2.5mg/L時(shí)，培養(yǎng)基的發(fā)芽率最高，當(dāng)6-BA濃度大于或者小于該濃度時(shí)，培養(yǎng)基的發(fā)芽率均明顯下降，因而，2.5mg/L6-BA濃度為最適宜培養(yǎng)千里香的濃度。

3.2 不同生長素種類對(duì)愈傷組織的影響

NAA、IBA均為植物組織培養(yǎng)常用的生長素，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，外植體處于不同培養(yǎng)基中發(fā)芽率略有不同，由表2可知，當(dāng)外植體處于含有生長素NAA的MS培養(yǎng)基中，發(fā)芽率優(yōu)于含生長素IBA的培養(yǎng)基，分析原因可能是INA促進(jìn)愈傷組織生根，尤其是不定根的生長，以及外植體的生長效果等方面略低于生長素NAA。

x3.3 活性炭（AC）對(duì)愈傷組織褐化的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在千里香組織培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間段均有褐化的現(xiàn)象發(fā)生，這在一定程度上影響了千里香的生長，有實(shí)驗(yàn)表明，褐化的發(fā)生及褐化程度對(duì)外植體的生長有一定的影響[7]，其中相對(duì)較大的材料褐化程度較輕，而較小的材料更容易發(fā)生褐化[8]。有報(bào)道稱，低濃度下的活性炭可以吸附培養(yǎng)基中的多酚氧化物及有毒物質(zhì)，所以可以有效地防止外植體的褐化[9]。通過比較有無活性炭發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加0.5mg/L的活性炭時(shí)，可以很好的抑制外植體褐化（圖1和圖2）。

3.4 溫度和光照對(duì)愈傷組織的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件可明顯降低褐化率，而高溫培養(yǎng)卻促進(jìn)褐化的發(fā)生，當(dāng)溫度較高時(shí)褐化率達(dá)52.7%[10]。但千里香適宜在溫?zé)岢睗竦沫h(huán)境中生長，因而，選擇的組織培養(yǎng)溫度為26℃，外植體的褐化率較低，同時(shí)也符合千里香的生長環(huán)境。

培養(yǎng)光照不適亦對(duì)外植體的生長產(chǎn)生影響，趙伶俐等人研究結(jié)果表明，2000lx光強(qiáng)培養(yǎng)的外植體褐化率較嚴(yán)重，1000lx和3000lx光強(qiáng)培養(yǎng)可降低外植體的褐化率[11]，因而，本次實(shí)驗(yàn)選擇2500lx光強(qiáng)，既可以有效降低褐化率也可以促進(jìn)外植體生長。

4 結(jié)語

現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)較常用的生長素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促進(jìn)外植體的腋芽伸長生長，NAA可促進(jìn)外植體的生根，本次實(shí)驗(yàn)篩選出適宜千里香外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的生長素濃度為6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同時(shí)，也驗(yàn)證了活性炭可有效抑制外植體發(fā)生褐化反應(yīng)，增加植物體的成活率，因而較為適宜千里香組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我國的一味中草藥材，有行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等功效，但人們主要研究其化學(xué)組成，至今還沒有看到相關(guān)組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)，通過本次實(shí)驗(yàn)，篩選出千里香較為適宜的外植體生長環(huán)境，將為千里香的無土栽培和進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)提供材料，也為其他植物的組織培養(yǎng)提供參考。

參考文獻(xiàn)

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作者簡介：徐紅紅（1988.03），女，黑龍江省鶴崗人，碩士，助教，從事千里香組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化工作。Emall：476486500@qq.com

通訊作者：潘永玖，Emall：345090614@qq.com