氧糖剝奪再灌注引起的SH-SY5Y細胞凋亡與NF-κBp65和COX-2蛋白表達的關(guān)系

黃 赟， 董艷軍， 肖 雁， 官志忠

氧糖剝奪再灌注引起的SH-SY5Y細胞凋亡與NF-κBp65和COX-2蛋白表達的關(guān)系

黃 赟1， 董艷軍2， 肖 雁1， 官志忠1

目的 探討氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后SH-SY5Y細胞凋亡情況及NF-κB信號通路NF-κBp65、COX-2蛋白的表達。方法 將SH-SY5Y細胞分為正常對照組、氧糖剝奪4 h/再灌注24 h組(OGD/R)組。利用流式細胞術(shù)分別檢測各組細胞凋亡率，蛋白印記法(Western blot)檢測p65和COX-2的蛋白表達情況。結(jié)果 與正常對照組比較，OGD/R組細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)，p65和COX-2的蛋白表達也明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 氧糖剝奪4 h/再灌注24 h能夠促進細胞凋亡，其機制可能是通過NF-κBp65對COX-2調(diào)控的信號通路來實現(xiàn)。

氧糖剝奪再灌注； 細胞凋亡； NF-κBp6； COX-2

缺血是引起細胞死亡的一個重要原因，然而醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，真正造成細胞死亡的原因并不是缺血本身，而是恢復(fù)血供后，過量的自由基對缺血細胞的攻擊造成的損傷，這種損傷叫做“缺血再灌注損傷”。而缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡則是造成細胞死亡的一個重要原因[1]。眾多研究表明，缺血再灌注后細胞凋亡率明顯增高[2,3]。然而細胞凋亡的相關(guān)機制及其涉及到的信號通路尚不十分明確。本研究以人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)為研究對象，通過構(gòu)建氧糖剝奪再灌注模型，模擬缺血再灌注損傷，對缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞的凋亡及可能機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材 料 細胞SH-SY5Y細胞株，為本實驗室本課題組穩(wěn)定保存。試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清、DMEM無糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物；p65抗體購自美國Cell Signaling公司；COX-2抗體購自美國Gentex公司；GAPDH購自美國Proteintech公司；HRP標記的抗鼠二抗、抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影定影試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購自美國Millipore公司；成像膠片購自柯達公司。儀器:流式細胞儀，美國BD公司；ELX800UV酶標儀，美國Bio-Tec公司；Western blot跑膠裝置，北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng) 采用常規(guī)細胞培養(yǎng)方法復(fù)蘇SH-SY5Y細胞，然后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將細胞稀釋至一定密度后置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 SH-SY5Y細胞氧糖剝奪模型的建立 實驗前1 d向三氣培養(yǎng)箱內(nèi)充入94%N2+5%CO2混合氣體，使培養(yǎng)箱內(nèi)氣體濃度為94%N2、%CO2、1%O2。將細胞按0.5×106個/ml的密度接種于6孔板。24 h后，觀察細胞已貼壁且生長良好，將細胞分為正常對照組和OGD/R組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。正常對照組于普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；而OGD/R組則將細胞取出，倒掉原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次(1 min/次)以除去原培養(yǎng)基中的葡萄糖和胎牛血清對后續(xù)實驗的影響。然后加入只含1%雙抗，不含血清的無糖培養(yǎng)基，最后將細胞置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。之后取出細胞，再以PBS清洗3次(1 min/次)后更換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于普通二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 OGD/R結(jié)束后，收集兩組細胞。用0.25%不含EDTA的胰酶消化后終止消化，用PBS清洗兩次，每次以1000 rpm/min的速度離心5 min。然后用400 μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細胞。在細胞懸浮液中加2.5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于4 ℃冰箱孵育15 min。之后再加入10 μl PI染色液后輕輕混勻于4 ℃冰箱孵育5 min。立即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 Western blot檢測p65和COX-2的蛋白表達 RIPA蛋白裂解液與PMSF按100∶1的比例混合后，每孔加入100 μl蛋白裂解液，將細胞于冰上裂解1 h。之后于4 ℃低溫離心機12000 r/min離心20 min，取上清，BCA法進行蛋白定量后以25 μg的蛋白總量上樣。制備8%-聚丙烯酰胺凝膠，以80 V電壓跑至蛋白Marker條帶分開后，將電壓調(diào)至120 V至電泳結(jié)束。然后以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜100 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST洗膜兩次，5 min/次，之后封閉液封閉2 h。封閉結(jié)束后TBST洗膜3次，5 min/次，最后一抗p65(1∶1000)、COX-2(1∶1000)、GAPDH(1∶20000)孵育于4 ℃冰箱過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜5次，5 min/次，p65和COX-2蛋白以抗兔二抗(1∶10000)孵育1 h，GAPDH蛋白以抗鼠二抗(1∶100000)孵育1 h，TBST洗膜1 h，最后暗室曝光，掃描條帶后使用Image J軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 細胞凋亡檢測結(jié)果 細胞凋亡情況用凋亡率表示，為早期凋亡與晚期凋亡之和。在流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC-/PI-；右上象限為晚期凋亡細胞，為FITC+/PI+；而右下象限為早期凋亡細胞，F(xiàn)ITC+/PI-(見圖1)。從圖上看出，對照組細胞主要分布在左下象限，只有少量細胞分布在右上象限和右下象限；而OGD/R組細胞在右上象限和右下象限都有明顯增加，說明早期凋亡細胞、晚期凋亡和壞死細胞增加。統(tǒng)計結(jié)果表明，OGD/R組與正常對照組相比細胞凋亡率明顯增加且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

2.2 NF-κBp65與COX-2蛋白表達情況 Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，OGD/R組p65和COX-2蛋白表達量均有顯著增高且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

a:正常對照組(Control組)；b:氧糖剝奪再灌注組(OGD/R組)

圖1 AnnexinV-FITC /PI雙染流式細胞術(shù)檢測凋亡

與Control組比較*P<0.05

與Control組比較*P<0.05

3 討 論

缺血再灌注造成的腦損傷是導(dǎo)致死亡和長期殘疾的一個主要因素[4]，在體外研究中，OGD/R模型是體外模擬腦缺血再灌注的常用模型。SH-SY5Y細胞株是人神經(jīng)母細胞瘤細胞，具有神經(jīng)細胞及腫瘤細胞的特點，因而廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。細胞凋亡(apoptosis)或程序化細胞死亡(programmed cell death，PCD)是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細胞主動死亡的過程[5]。凋亡過程中細胞發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)的改變，目前在體內(nèi)體外均有多種方法可以檢測這些改變以反映凋亡過程，如形態(tài)學(xué)檢測法、DNA片段化檢測、TUNEL檢測法等；流式細胞術(shù)、線粒體膜電位檢測等[6]。

本實驗研究以SH-SY5Y細胞為研究對象構(gòu)建OGD/R模型，以AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)為檢測手段檢測細胞凋亡。從實驗結(jié)果可以看到，正常對照組細胞只有少量細胞凋亡。當(dāng)OGD/R發(fā)生時，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞數(shù)明顯增多，表明SH-SY5Y細胞凋亡率明顯增高，說明對細胞進行OGD/R處理后可明顯誘發(fā)SH-SY5Y細胞凋亡。

核因子-κB(NF-κB)是細胞內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，其典型代表是p50/p65異源二聚體，NF-κBp65在缺血引起的程序性細胞死亡包括細胞凋亡和自噬中起重要作用[7～9]。Zhang等在研究短暫性腦缺血發(fā)作的實驗中發(fā)現(xiàn)，NF-κBp65激活與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，且抑制NF-κBp65活化對神經(jīng)細胞凋亡有保護作用[10]。COX-2為誘生型環(huán)氧化酶，是炎性反應(yīng)的標志物，也是腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵酶[11]。它是NF-κB信號通路中一種重要的蛋白分子，對腦缺血損傷有重要作用，也對激活NF-κB有重要意義[12]。有報道指出，當(dāng)缺血再灌注損傷發(fā)生時，大鼠腦組織中COX-2表達增加[13]。本課題組前期研究表明，缺血再灌注大鼠海馬NF-κBp65及COX-2的表達均高于正常SD大鼠[14]。本次研究利用Western blot技術(shù)對NF-κBp65和COX-2在SH-SY5Y細胞中的表達量進行測定，發(fā)現(xiàn)OGD/R后，細胞NF-κBp65和COX-2的表達量較正常對照組都有明顯增高。說明當(dāng)OGD/R發(fā)生時可能激活了NF-κB信號通路，NF-κBp65又對其下游的COX-2產(chǎn)生作用，使其表達量增高。

綜上所述，當(dāng)對SH-SY5Y細胞進行氧糖剝奪4 h、再灌注24 h處理后，細胞凋亡率較正常細胞明顯上升，且NF-κB信號通路被激活，說明其產(chǎn)生凋亡的機制可能是通過NF-κBp65激活COX-2實現(xiàn)的。

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The relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion

HUANGYun,DONGYanjun,XIAOYan,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To explore the relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R).Methods Cells were divided into normal control group and oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h groups.The cell apoptosis rate was analyzed using flowcytometry,and Western blot assay was used to evaluate the expression of p65 and COX-2 proteins in control group and OGD/R group.Results Compared with the normal control group,the apoptosis rate of OGD/R group was significantly higher (P<0.05),and the protein expression of p65 and COX-2 was also significantly increased (P<0.05).Conclusion Oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h can induced apoptosis,which may be through the signaling pathway that NF-κB p65 regulates COX-2 to achieve.

Oxygen-glucose deprivation/reperfusion; Apoptosis; NF-κBp65; COX-2

2016-10-09；

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金(No. 81160149)；貴州省科技廳基金項目[黔科合J字(2014)2012]

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004)

肖 雁，E-mail：xiaoyanhonan@hotmail.com

1003-2754(2017)02-0119-03

R743.3

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