丹參酮ⅡA對腦出血大鼠腦組織HIF-1α和VEGF表達的影響

趙紅領， 李 磊， 苗 成， 楊 慧， 常文廣

丹參酮ⅡA對腦出血大鼠腦組織HIF-1α和VEGF表達的影響

趙紅領， 李 磊， 苗 成， 楊 慧， 常文廣

目的 探討丹參酮ⅡA對腦出血大鼠的干預作用以及對HIF-1α和VEGF表達的影響。方法 將大鼠隨機分為假手術組、腦出血組、丹參酮ⅡA干預I組和II組，除假手術組外，其余大鼠均通過注射膠原酶的方法建立腦出血模型，丹參酮IIA干預Ⅰ組和Ⅱ組分別腹腔注射丹參酮IIA30 mg/kg，每天一次和30 mg/kg，每天兩次，共給藥15 d。給藥完成后，對各組大鼠進行神經功能缺損評分，稱重法計算腦組織的含水量，免疫組化法與實時熒光定量PCR檢測腦組織中HIF-1α和VEGF的蛋白表達與mRNA表達。結果 與腦出血組相比，丹參酮IIA干預組大鼠的神經功能缺損評分顯著升高，腦組織含水量顯著下降，腦組織中HIF-1α和VEGF的蛋白表達與mRNA表達顯著升高。結論 丹參酮IIA對腦出血大鼠腦組織具有保護作用，其作用機制可能與HIF-1α和VEGF因子的表達有關。

腦出血； 丹參酮IIA； HIF-1α； VEGF

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經系統常見疾病，臨床上常見，占腦卒中的比例約為20%～40%，發病率和致殘率較高，我國腦出血的發病率約為17.1%～55.4%[1]。隨著人口結構的老齡化加劇以及飲食結構的變化，腦出血的發病率逐漸上升，發病后約有75%的患者致殘，治療期與恢復期的高額費用對患者家庭是一種沉重的負擔。

丹參在國內廣泛用于治療心腦血管疾病，丹參酮IIA(Tanshinone ⅡA)是丹參的主要活性單體，具有抗氧化、清除自由基、抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性[2,3]。多項研究表明丹參酮IIA對腦缺血再灌注損傷中，通過抑制線粒體裂解，調節bcl-2/bax的表達，增加谷胱甘肽過氧化物酶的活性，清除自由基，抑制細胞凋亡，從而發揮神經保護的作用[4,5]。此外，30 mg/kg丹參酮ⅡA能夠減少腦梗死大鼠的腦梗死體積，具有很好的腦保護作用[6]。本實驗擬通過注射膠原酶的方法建立腦出血大鼠模型，觀察丹參酮ⅡA對腦出血大鼠腦組織的保護作用，并討論可能的初步機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，SPF級，8～12周齡，體重200～240 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2012-0012；飼養條件：22 ℃～26 ℃，濕度50%～60%，分籠，標準飼料和純凈水喂養，進行適應性飼養1 w。

1.2 實驗試劑 丹參酮IIA購自上海芃碩生物科技有限公司(丹參酮ⅡA混懸于1%的二甲基亞砜的PBS平衡鹽溶液制成混懸液)；膠原酶購自Sigma公司；HIF-1α和VEGF抗體購自Abcam公司；HIF-1α、VEGF和GADPH引物由上海英駿生物工程公司提供；其他試劑為國產試劑。

1.3 實驗分組與腦出血大鼠模型的建立 將40只大鼠隨機分為4組：假手術組(Sham)、腦出血組(ICH)、丹參酮IIA干預I組(Tan-Ⅰ)和II組(Tan-Ⅱ)；除假手術組外，其余各組小鼠參考Rosenberg等[7]方法，建模前12 h禁食禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥固定大鼠，沿頭顱正中切開皮膚，暴露前囪，于右側尾殼核體表前囪垂直3 mm后，側開1 mm處，用顱骨鉆開此處，用微量進樣器將2 μl膠原酶勻速注入，進針深度為5.5 mm，留針5 min，取出微量進樣器，縫合切口，術后腹腔注射青霉素80萬單位預防感染。模型成功判定標準：建模后可見明顯肢體癱瘓，沿針孔冠狀切面可見腦組織中有血腫形成。建模后，丹參酮IIA干預Ⅰ組大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天一次；Ⅱ組大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天兩次，共給藥15 d。

1.4 神經功能缺損評分 各組大鼠于造模成功后3 d、6 d、9 d、12 d和15 d，依據Garcia等[8]方法進行神經功能評分，分值范圍3～18分，分值越低，神經功能障礙越嚴重。評分標準：自發活動(0～3分);四肢對稱運動(0～3分);前肢對稱外展(0～3分);爬鐵籠壁(1～3分);軀干對鈍棒觸及的反應(1～3分);觸須對鈍棒觸及的反應(1～3分)。

1.5 標本采集 在給藥完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭，打開頭顱，取出腦部，分離出血腫組織。

1.6 腦組織含水量 深度麻醉大鼠，斷頭取腦，沿中線切開，精密稱量濕重(wwt)，放置于80 ℃烘箱烘烤48 h，直至恒重，稱量干重(dw)，計算腦組織含水量(%)=(wwt-dw)/wwt×100%。

1.7 免疫組化法檢測HIF-1α和VEGF蛋白含量 將腦組織制作成石蠟切片，二甲苯脫蠟，依次浸入梯度酒精(100%、95%、85%、75%)各5 min，加入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復20 min，PBS洗滌，加入封閉液室溫孵育10 min，PBS洗滌，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，隨后加入對應二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，再次用梯度酒精脫水(75%、85%、95%、100%)，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8 實時熒光定量PCR 將腦血腫組織勻漿后加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，12000 rpm 4 ℃離心15 min，提取總RNA，以逆轉錄酶催化合成cDNA，以cDNA為模板在聚合酶催化下進行PCR反應， HIF-1α引物：上游5’-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3’，下游5’-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3’；VEGF引物：上游5’-CAGCCCCAGCTACCACCTC -3’，下游5’-TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC-3’;GADPH引物：上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’；93 ℃ 42 s， 60 ℃ 40 s，73 ℃ 55 s，共32個循環，實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，目標基因的相對定量用2-△△CT計算。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評分 進行腦出血造模后，大鼠出現了神經功能缺損的癥狀，腦出血組大鼠在6 d時達到峰值，丹參酮ⅡA干預組在相同時間的神經功能缺損癥狀輕于腦出血組，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 腦組織含水量的測定 腦出血組大鼠同側腦組織的含水量(83.35%±0.72%)顯著高于假手術組(72.23%±0.64%);丹參酮ⅡA干預組Ⅰ組(79.18%±0.62%)和Ⅱ組(75.58%±0.43%)的腦組織含水量均顯著低于腦出血組(P<0.05)，差異具有統計學意義。

2.3 HIF-1α和VEGF蛋白表達的變化 腦出血組大鼠腦組織的HIF-1α和VEGF的免疫陽性細胞數明顯高于假手術組(P<0.05);丹參酮ⅡA干預組的HIF-1α和VEGF的免疫陽性細胞數顯著高于腦出血組(P<0.05)，差異具有統計學意義。

2.4 HIF-1α和VEGF mRNA表達水平的變化 腦出血組大鼠腦血腫組織的HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平明顯高于假手術組(P<0.05);丹參酮ⅡA干預組的HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平顯著高于腦出血組(P<0.05)，差異具有統計學意義。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分(±s)

與假手術組組對比*P<0.05；與ICH組相比#P<0.05

3 討 論

腦出血是常見的非外傷性致死性疾病，目前仍缺乏有效可靠的治療方法。腦出血后導致急性腦水腫以及血腫周圍腦組織缺血缺氧，繼發造成神經組織損傷。主要是由于血腫周圍組織血流量減少、乳酸堆積、血腫活性物質釋放等引起血腫周圍腦組織缺血缺氧、神經元凋亡，從而出現神經組織損傷。腦出血后腦含水量的增加，推測是由于腦細胞內鈉鉀泵功能的失調，從而引起腦組織出現水分的異常增加。丹參酮ⅡA能夠降低腦出血后腦含水量，可能與其抑制炎性細胞和炎性因子的滲入，而產生的毒性作用，形成細胞毒性水腫。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α，Hypoxia inducible factor-1α)是連接在促紅細胞生成素基因的低氧反應的一種核轉錄因子[9，10]，在正常狀態下組織幾乎不表達，但在低氧狀態下，HIF-1α的表達增高，并隨缺氧程度與缺氧時間相關[11]。國內報道指出HIF-1α的陽性表達率隨腦出血時間延長而增加[12]，研究發現缺氧誘導生成的HIF-1α具有保護腦組織損害的作用[13]。我們的實驗結果顯示，腦出血大鼠腦組織中HIF-1α顯著增加，使用丹參酮ⅡA干預后，血腫周圍腦組織中HIF-1α的表達明顯高于腦出血組，提示HIF-1α表達的上調對腦出血后腦組織的損傷具有保護作用。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α的目的基因，作為血管內皮細胞分裂原，能夠特異性誘導內皮細胞的有絲分裂，促進血管內皮細胞增殖，修復血管內膜，維持內膜完整性。在血管形成之前，VEGF對神經系統具有直接的保護作用[14]。報道指出，VEGF具有一定的促神經再生作用，在腦缺血灶周腦組織中VEGF的表達顯著上升，微血管密度顯著增加，有效改善缺血半暗帶的血塊[15,16]。我們的實驗結果顯示，使用丹參酮ⅡA干預后，血腫周圍腦組織的VEGF表達顯著高于腦出血組，推測丹參酮ⅡA通過調節VEGF的表達，改善血管內皮細胞功能，促進血管新生，提高微血管的抗損能力，從而發揮保護腦出血損傷的腦組織。

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Effects of Tanshinone ⅡA on HIF-1α and VEGF expression in brain tissue of intracerebral hemorrhage rats

ZHAOHongling,LILei,MIAOCheng,etal.

(DepartmentofNeurology,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China)

Objective To investigate the improvement of Tanshinone ⅡA on intracerebral hemorrhage (ICH) the effects on HIF-1α and VEGF expression.Methods Rats were randomly divided into 4 groups:sham,ICH,ICH treated with Tanshinone ⅡA once a day and ICH treated with Tanshinone IIA twice a day.In addition to sham rats,the rats were injected with collagenase to established ICH model,and then were injected with 30 mg/kg of Tanshinone ⅡA intraperitoneally once or twice a day.At the end of 15-day experimental period,rats neural function of each group was scored and the water content in brain were calculated accordingly.The expression of HIF-1α and VEGF were determined by western blot and quantitative PCR,respectively.Results Compared with ICH group,the neural function was significantly improved and the water content in brain was decreased after Tanshinone ⅡA administration.Moreover,Tanshinone IIA treatment resulted in a markedly increase of HIF-1α and VEGF expression when compared with ICH rats.Conclusion Tanshinone ⅡA treatment can improve the neural function in brain tissue of ICH rats,which may be related with the regulation of HIF-1α and VEGF expression.

Intracerebral hemorrhage; Tanshinone ⅡA; HIF-1α; VEGF

1003-2754(2017)02-0130-03

2016-10-26；

2016-11-29

(新鄉市中心醫院神經內科，河南 新鄉 453000)

趙紅領，E-mail:honglingzhao69@163.com

R743.34

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