進展性腦梗死患者血清HMGB1、FKN動態變化研究

蓋昱辛, 盛寶英， 韓 鳳， 魏春杰， 李叢言

進展性腦梗死患者血清HMGB1、FKN動態變化研究

蓋昱辛, 盛寶英， 韓 鳳， 魏春杰， 李叢言

目的 探討高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及不規則趨化因子(FKN)在進展性腦梗死中的可能作用機制。方法 用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測急性腦梗死患者不同時期血清HMGB1及FKN水平變化，根據斯堪的納維亞腦卒中量表(scandinavian stroke scale,SSS)評分分為進展組和非進展組。根據梗死體積將180例患者分為大梗死灶組、中梗死灶組、小梗死灶組。另納入30例健康體檢者作為對照組。結果 180例急性腦梗死患者中有35例(19.44%)發展為進展性腦梗死。進展組SSS基線評分低于非進展組，差異有統計學意義(P<0.05)。進展性組患者發病后1 d、7 d、14 d血清HMGB1、FKN水平高于非進展組和對照組，有統計學意義(P<0.05)。梗死灶體積大則血清HMGB1、FKN水平高(P<0.05)。結論 血清HMGB1、FKN增加可能通過增加炎癥反應促進動脈粥樣硬化形成和進展，加重腦組織損傷，導致腦梗死患者病情進展。

進展性腦梗死； HMGB1； FKN

進展性腦梗死指發病后6 h～1 w內神經功能損害進行性加重或雖經臨床治療病情仍呈進展性惡化的一類腦梗死，約占腦梗死的20%～40%。目前已經明確腦梗死的主要病理基礎是動脈粥樣硬化，而炎癥損傷機制在動脈粥樣硬化病理損傷中的作用和地位尤為突出。腦缺血發生后，機體發生一系列免疫防御反應，眾多炎癥介質、趨化因子異常表達與釋放對腦組織產生直接和間接的毒性作用是神經元繼發損傷重要的病理基礎。高遷移率族蛋白 1(high mobility group Box-1，HMGB1)是高度保守的核蛋白，當組織受到內源性刺激或外源性刺激后，可釋放至細胞外，與受體結合后作為重要的炎癥介質參與局部及全身的炎癥反應過程[1]。在動脈粥樣硬化的病理改變中，激活的平滑肌細胞和單核巨噬細胞是 HMGB1 的重要來源，能促進動脈粥樣硬化的進展和易損斑塊破裂[2]。不規則趨化因子(Fractalkine/CX3CL1，FKN)是一種兼具介導細胞黏附和趨化雙重生物學作用的趨化因子，可通過加強淋巴細胞、單核細胞向血管內皮細胞趨化、黏附導致血管內皮細胞受損，也可通過增加血小板活化及黏附，促進動脈粥樣硬化斑塊形成[3]。本研究通過檢測進展性腦梗死患者和非進展性腦梗死患者不同時期血清HMGB1及FKN水平變化，探討其是否能影響腦梗死進展。

1 材料與方法

1.1 一般資料 研究對象：選取2015年6月-2016年6月我院神經內科住院治療的急性腦梗死患者180例。根據入院后腦梗死是否進展分為進展組和非進展組，其中進展組患者35例，男24例，女11例，平均年齡(56.20±7.22)歲；非進展組患者145例，男86例，女59例，平均年齡(54.84±7.86)歲。根據發病后24 h頭部CT計算腦梗死體積，腦梗死體積>10 cm3為大梗死灶組(54例)；體積4～10 cm3為中梗死灶組(64例)；體積<4 cm3為小梗死灶組(62例)。另外，選擇同期30例健康體檢者作為對照組，其中男20例，女10例，平均年齡(55.87±7.54)。診斷標準：急性腦梗死患者符合《中國急性缺血性卒中診治指南2014》的診斷標準[4]。進展性腦梗死患者符合2003年歐洲進展性腦卒中研究組(European Progressing Stroke Study Group,EPSS)制訂的進展性腦梗死診斷標準[5]。發病第3天神經系統癥狀和基線評分對比，在SSS評分里的意識水平、上下肢運動或者眼球運動加重≥2分(或)在言語功能加重≥3分或發病后72 h以內死亡的患者。排除標準：其他腦部疾病(顱內占位、顱腦外傷、顱內感染、腦出血)、感染性疾病、血液病、風濕免疫病、急性心血管事件、重度肝腎功能衰竭等患者。

1.2 方法 病例組分別于入院第1天、第7天、第14天，對照組于查體當天，均抽取空腹靜脈血3 ml，于3000 r/min離心15 min，分離上層血清，-20 ℃冰箱保存，用于檢測HMGB1和FKN。HMGB1、FKN均采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)，試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

2 結 果

2.1 進展組與非進展組一般臨床資料、SSS基線評分、梗死灶體積、梗死部位對比 180例急性腦梗死患者中有35例發展為進展性腦梗死，占急性腦梗死患者的19.44%。 兩組患者一般臨床資料上不存在統計學差異(P>0.05)。梗死部位與梗死灶體積不存在統計學差異(P>0.05)。進展組SSS基線評分低于非進展組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 進展組、非進展組、對照組患者血清HMGB1測定結果比較 進展組患者不同時間血清HMGB1水平高于同期的非進展組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；非進展組患者不同時間血清HMGB1水平高于同期的對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.3 進展組、非進展組、對照組患者血清FKN測定結果比較 進展組患者不同時間FKN水平高于同期的非進展組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；非進展組患者不同時間FKN水平高于同期的對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

2.4 急性腦梗死患者梗死灶體積與發病第1天血清HMGB1、FKN水平的關系 大梗死灶組患者血清HMGB1、FKN水平高于中梗死灶組、小梗死灶組(P<0.05)；中梗死灶組患者血清HMGB1、FKN水平高于小梗死灶組(P<0.05)(見表4)。

表1 進展組與非進展組一般臨床資料、SSS基線評分梗死灶體積、梗死部位對比

與非進展組比較*P<0.05

表2 3組血清HMGB1測定結果比較(pg/ml)

與對照組比較*P<0.05；與非進展組比較#P<0.05

表3 3組血清FKN測定結果比較(pg/ml)

與對照組比較*P<0.05；與非進展組比較#P<0.05

表4 急性腦梗死患者不同梗死灶體積與血清HMGB1、FKN水平比較

與小梗死灶組比較*P<0.05；與中梗死灶組比較#P<0.05

3 討 論

進展性腦梗死發生機制尚未完全明確，其危險因素有血壓、血糖、發熱、感染、癲癇發作、腦水腫等。病理生理機制包括動脈硬化斑塊的破裂、炎性介質的激活、自由基損傷、興奮性氨基酸毒性作用等。急性腦血管病發生的早期標志即是動脈粥樣硬化，鑒于目前認為動脈粥樣硬化本質上是一種多器官系統的無菌性炎癥性疾病[6]，所以，研究影響動脈粥樣硬化進程的炎性反應受到廣泛重視。動脈粥樣硬化始于血管內皮功能障礙，血管內皮損傷后，其維持血管穩態、預防血栓等作用減弱，血管內平衡被破壞，在這慢性病理過程中，單核細胞遷移、泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞增殖和炎性細胞浸潤，形成粥樣斑塊。炎性反應的激活調節著動脈粥樣硬化的形成、易損斑塊的破裂，加重供血動脈的硬化與狹窄，是腦卒中進展的高危因素。吞噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞在斑塊內的浸潤數目，一定程度上可反應斑塊的炎癥嚴重程度和判定斑塊的不穩定性。

流行病學資料顯示，進展性腦梗死的發生率國內外統計數據差別較大，國內約20%～40%；國外為9%～43%。本組研究選取一段時間內發生急性腦梗死患者180例，其中病情進展的患者為35例，約占總樣本數19.4%，與國內統計數據有所差別。其原因可能為近年患者就醫及時和醫從性增高、治療方案更新、影像學檢查的發展、對心腦血管疾病危險因素的預防加強。且來我院就診患者的特點、腦梗死的分型、進展性腦梗死診斷標準的使用不同所得出的結論也存在差異。研究過程中發現進展組患者入院時SSS基線評分低于非進展組，有統計學意義，其原因可能為SSS評分低意味著缺血損害范圍廣泛，累及語言、意識、肢體運動等方面功能，發生狹窄的血管往往是頸內動脈、大腦中動脈等大血管，發生閉塞時，缺乏有效的側枝循環，缺血半暗帶區發生不可逆損傷，使病情發生進展。

HMGB1屬于高遷移率族蛋白家族，因其在凝膠電泳時泳動速度快而得名，廣泛存在于哺乳動物的細胞核中，受到病理性損傷或內源性致炎因子刺激后可釋放到細胞外[7]。作為炎癥反應的關鍵調控分子，在腦梗死免疫炎癥過程發揮的生物學作用逐漸受到重視。HMGB1主要表達于內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞。在動脈粥樣硬化病變內膜處，HMGB1不僅在胞漿中表達增加而且還能彌散釋放到斑塊基質內，刺激巨噬細胞的遷移、平滑肌細胞聚集，并募集其它免疫細胞以及增加多種炎癥介質MCP-1,VCAM-1等釋放[8]。在大腦中動脈閉塞動物模型中，HMGB1最初出現在神經元胞漿，而后迅速消失，被分泌至胞外[9]。釋放至細胞外的HMGB1一方面可作為早期炎癥介質，介導多種細胞合成和分泌炎性介質和促炎細胞因子，放大了腦組織的缺血再灌注損傷和炎癥反應[10]；另一方面也可認為是晚期炎癥介質，激活單核巨噬細胞，主動分泌HMGB1，促進平滑肌細胞增殖并遷移至內膜，在趨化因子作用下，使更多炎癥細胞聚集，進一步放大炎癥反應。綜上所述，前期研究已表明HMGB1在動脈粥樣硬化的進展過程中扮演的上游炎癥介質作用已被廣泛證實，腦卒中后，由于血腦屏障破壞，HMGB1可以從中樞神經系統釋放入外周血，通過測定血清中的HMGB1水平可以反映中樞神經系統HMGB1的表達水平以及腦損傷的程度。本實驗結果顯示，血清HMGB1水平在發生腦梗死時會有明顯持續性升高，在第7天達到高峰，進展組患者高于同時期非進展組及正常對照組，在腦缺血2 w后仍呈較高水平表達。說明進展性腦梗死的無菌性炎癥較非進展性更為劇烈。梗死發生后，HMGB1的過度表達提示著腦組織損傷后產生大量炎癥因子抗原，引起嚴重的免疫應答反應，進而激活多種炎癥細胞釋放致炎因子，調控周圍炎性反應，維持和放大生物學效應，HMGB1作為一種多效應的炎癥調節因子，其強烈的致炎作用使動脈粥樣硬化進展、斑塊破裂、腦損傷加劇，可能對腦梗死進展有預測意義。

FKN屬于CX3C家族，主要表達于血管內皮細胞和神經細胞表面，有膜結合型和分泌型兩種形式，膜結合型能誘導內皮細胞活性，促進白細胞黏附；分泌型對單核細胞有強烈趨化作用。動脈粥樣硬化灶內主要是淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，暗示這些炎癥細胞參與局部炎癥反應。在動脈粥樣硬化形成和發展過程中，泡沫細胞的前體細胞即單核細胞的聚集和激活貫穿始終，FKN在其向血管壁遷移過程中起關鍵作用。FKN可通過與高親和力受體CX3CR1結合通過G蛋白偶聯啟動細胞內轉導機制，發揮調節免疫和白細胞趨化作用，吸引炎性細胞在損傷區域聚集，誘導炎癥表達，加速炎癥反應。在損傷的血管內皮細胞以及動脈硬化斑塊中，FKN和其受體CX3CR1均存在過度表達，且和病情嚴重程度成正比[11]。腦組織缺血 6 h時FKN即有所升高，高水平FKN可持續至發病90 d后[12]，在大鼠MCAO模型中，CX3CR1缺陷(CX3CR1-/-)大鼠梗死后面積減小，血腦屏障破壞減輕，凋亡神經元減少，ROS水平降低，神經功能也有所改善[13]。血漿FKN增高提示血液中促炎因子水平與體內炎癥反應的嚴重程度增高導致腦組織損傷的加重，一般炎癥因子產生的高峰期約在1 w左右，而本實驗結果中進展性腦梗死患者FKN水平在第1天即達到高峰，持續時間也較無進展的腦梗死組長。提示FKN一方面可能通過促進炎癥細胞的趨化滲出，激活浸潤的白細胞產生釋放活性氧、自由基等，使腦損傷程度加重；同時加速斑塊內的炎癥反應使纖維膜損傷、泡沫細胞增多，加快斑塊破裂，導致腦梗死進展；另一方面隨著腦組織炎癥反應的加劇，內皮細胞在細胞因子的作用下產生更多的FKN，進展性腦梗死患者病情更嚴重，炎癥細胞活化觸發了梗死后炎癥的“瀑布鏈”，放大了炎癥的級聯反應，加重了腦水腫和神經細胞的凋亡，故FKN水平明顯升高且高峰提前。可以推測FKN可能是反應腦梗死患者病情進展的標志物。

在血清HMGB1、FKN水平與梗死體積關系分析中可看出，大梗死灶組高于中梗死灶和小梗死灶，說明梗死體積越大血清HMGB1、FKN水平越高。在腦缺血發生后，激活的單核巨噬細胞可主動分泌HMGB1，促進平滑肌細胞增殖并遷移至內膜，在趨化因子作用下，使更多炎癥細胞聚集，內皮功能失代償，通過級聯效應誘導局部炎癥反應放大。而FKN可趨化泡沫細胞的前體細胞即單核細胞向血管壁遷移，吸引炎性細胞在損傷區域聚集，加速炎癥反應。二者可協同作用通過調節局部炎癥反應進而導致病灶擴大和神經功能缺損加重。

炎癥在動脈粥樣硬化的發生、不穩定斑塊的破裂和血栓形成過程中起關鍵作用，是造成進展性卒中的重要原因。斑塊內炎性反應促進斑塊破裂,腦缺血后大量炎癥因子異常表達和釋放，對腦組織產生直接和間接的毒性作用，形成惡性循環，引起血栓的擴大及炎癥的繼發損害。因此，炎性標記物是判斷腦血管事件發生發展程度的良好實驗室補充指標。HMGB1、FKN水平升高所介導的炎癥的級聯反應可能參與進展性腦梗死病理損傷過程。通過監測HMGB1、FKN有助于早期判斷進展性腦梗死，對于臨床干預有一定的指導意義。

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Changes and clinical significance of serum HMGB1，FKN inpatients with progressive ischemic stroke

GAIYuxin,SHENGBaoying,HANFeng,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Heilongjiang,Jiamusi154000,China)

Objective To investigate the role of high mobility group box (HMGB) 1 and fractalkine/CX3CL1 (FKN) in progressive ischemic stroke.Methods The serum levels of HMGB1 and FKN in patients with acute cerebral infarction at different perids were detected by ELISA.According to Scandinavian Stroke Scale(SSS),patients divided into progressive group and non-progressive group.According to the infarct volume,180 cases were divided into large infarction group,middle infarction group and small infarction group.30 asymptomatic healthy individuals who underwent annual health check up were chosen as control.Results Among 180 patients,35 patients (19.44%) were progressive stroke.The SSS basic score of progressive group was lower than non-progressive group (P<0.05).The levels of HMGB1,FKN in progressive group were higher than non-progressive group and control group at the 1st,7th,14th day after stroke onset(P<0.05).The levels of HMGB1,FKN was higher in patients with bigger size infarction (P<0.05).Conclusion The increase of the levels of HMGB1,FKN may promote and formate of atherosclerosis through increaseing the inflammatory response,which may deteriorate brain injury and lead to early neurological evolution.

Progressive ischemic stroke； HMGB1； FKN

1003-2754(2017)02-0141-04

2016-12-27；

2017-01-29

(佳木斯大學附屬第一醫院神經內科，黑龍江 佳木斯 154000)

盛寶英，E-mail：shengbaoying123@163.com

R743.3

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