CJ016對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究

甘 萍，譚永紅，金偉華，王玲潔，于波濤

(成都軍區總醫院藥劑科，四川 成都 610083)

CJ016對人肺癌裸鼠移植瘤的抑制活性研究

甘 萍，譚永紅，金偉華，王玲潔，于波濤

(成都軍區總醫院藥劑科，四川 成都 610083)

目的 研究CJ016對人肺癌模型的治療效果及其作用機制。方法 建立人肺腺癌細胞A549裸鼠移植瘤模型，考察CJ016體內抑制腫瘤生長效果；同時將腫瘤進行免疫組化檢測，考察其對腫瘤內CD31和細胞凋亡的影響。結果 CJ016對A549細胞增殖有明顯抑制作用，其IC50值為34.22 nmol·L-1；動物實驗表明其具有較好的腫瘤抑制效果，抑瘤率、T/C%值分別為70.08%和27.75%(20 mg·kg-1)；同時，CJ016能降低腫瘤細胞內CD31的表達，促進腫瘤細胞凋亡。結論 CJ016能明顯抑制A549細胞荷瘤小鼠腫瘤生長，其可能的作用機制是減少血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡。

肺癌；作用機制；CJ016；A549；IC50；CD31；細胞凋亡

癌癥，即惡性腫瘤，是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一。長期以來，體內基因的表達異常如基因突變、缺失、重組以及擴增被認為是腫瘤發生發展的起因。與此同時，越來越多的證據表明，除了基因序列的改變外，表觀遺傳的改變也會致使腫瘤的發生和發展。其中值得注意的是，與基因突變相比，表觀遺傳的變化過程是可逆的。因此，調節或干預表觀遺傳漸漸成為治療腫瘤的一個很有吸引力的靶點[2-3]。近年來，研究發現組蛋白的乙酰化和去乙酰化作用是調節染色質結構和基因表達的重要的表觀遺傳現象，這與腫瘤的發生發展有著密切的聯系。組蛋白的乙酰化和去乙酰化作用分別受到組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)的調節。其中，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一類能調節染色質結構和基因表達的蛋白酶。HDACs的主要作用是催化組蛋白氨基酸末端賴氨酸殘基的去乙酰化，導致染色質凝結和轉錄抑制。此外，HDACs還能通過調節蛋白的乙酰化狀態，影響蛋白轉錄后修飾。腫瘤細胞中常見HDACs的表達異常，抑制腫瘤細胞中HDACs的活性，可誘導腫瘤細胞生長阻滯、分化或者凋亡，能夠從多通路、多靶點共同作用來阻止腫瘤的發生發展，因而HDAC抑制劑已漸漸成為抗腫瘤藥物研發中炙手可熱的靶點[6-8]。通過前期篩選工作，編號為CJ016的化合物被篩選出為最優化合物，本文初步探索了化合物CJ016的體內外抗腫瘤活性、作用靶點及抗腫瘤分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 CJ016來自本課題組；DMEM培養基、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、100×青霉素-鏈霉素混合液購自美國HyClone公司；胎牛血清購自內蒙古呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；紫杉醇注射液購自太極集團四川太極制藥有限公司；CD31抗體購自Santa Cruz公司；凋亡檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.1.2 主要儀器 CO2恒溫培養箱、超凈工作臺、數碼倒置顯微鏡、常溫離心機、全波長酶標儀、石蠟切片機。

1.1.3 實驗動物和細胞株 BALB/c裸鼠，SPF級，♀，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號編號：SCXK(京)2014-0004；所用細胞來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由本實驗室培養并保種。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定CJ016對細胞生長的抑制作用 取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化細胞并制成細胞懸液，以3×107·L-1的細胞濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，在5% CO2飽和濕度的37℃培養箱中培養[1,4]。24 h后，加入不同濃度的CJ016處理，繼續培養72 h。按每孔10%加入MTT(以PBS配成5 g·L-1)，繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀上震蕩10 min，檢測490 nm處吸光度(A)值，計算細胞存活率：細胞存活率/%=(實驗組A值-陰性對照組A值)/(空白對照組A值-陰性對照組A值)×100%，并統計出IC50值，以上實驗重復3次(n=6)。

1.2.2 A549細胞裸鼠移植瘤模型建立 將A549細胞進行傳代擴大培養，收集細胞并用生理鹽水調節細胞濃度為每毫升2×107個細胞。于超凈工作臺內，按0.1 mL每鼠接種于裸鼠右側腋下，待腫瘤體積超過100 mm3時開始進行分組、給藥[5,12]。實驗分為5組：空白對照組，生理鹽水，尾靜脈注射，0.2 mL每鼠，2 d一次；陽性對照紫杉醇組，紫杉醇(paclitaxel,PTX)20 mg·kg-1，腹腔注射，7 d一次；CJ016給藥組(5、10、20 mg·kg-1)，尾靜脈注射，0.2 mL每鼠，2 d一次。給藥期間觀察并記錄裸鼠狀態，每2天測量腫瘤體積和裸鼠體重，給藥d 20時處死裸鼠，剖離腫瘤，稱重并計算抑瘤率(n=6)。

1.2.3 抗腫瘤活性評價方法 抑瘤率/%=(空白對照組腫瘤重量-治療組腫瘤重量)/空白對照組腫瘤重量×100%；腫瘤體積(tumor volume，TV)的計算公式為：TV=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長寬。根據測量結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV )，計算公式為：RTV=Vt/V0，其中V0為開始給藥時所測得腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。同時計算出相對腫瘤增殖率(T/C%值)：T/C%=TRTV/CRTV×100%，其中TRTV為治療組相對腫瘤體積，CRTV為空白對照組相對腫瘤體積[9-10]。

1.2.4 免疫組化檢測 治療終點時，將瘤組織于4%多聚甲醛中固定，經脫水、透明、滲蠟、包埋、切片，用CD31抗體進行染色，觀察腫瘤組織中微血管密度(MVD)。按凋亡檢測試劑盒操作方法，經酶處理、標記、DBA顯色、蘇木精復染、鏡檢，凋亡細胞呈棕黃色，記錄腫瘤細胞凋亡情況(n=3)。

2 結果

2.1 CJ016對腫瘤細胞生長的抑制作用 實驗結果顯示，CJ016對多種腫瘤細胞株有抑制作用，其中對肺癌細胞系最為敏感(Tab 1)。在多株肺癌細胞IC50結果均小于1 μmol·L-1，其中在A549細胞株的IC50值達34.22 nmol·L-1，顯示出較好的抑制作用。

2.2 CJ016體內抗腫瘤藥效結果 腫瘤體積生長曲線和腫瘤重量稱量結果見Fig 1、Tab 2。由結果可以看出，CJ016在5 mg·kg-1時即顯示腫瘤抑制作用，體積測量和瘤重稱量結果與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.01)；同時，隨劑量增加抑制作用也相對增強，在20 mg·kg-1劑量時對腫瘤生長抑制作用最好，其抑瘤率達70.08%，超過陽性對照紫杉醇組(69.54%)，顯示出較好的抗腫瘤效果；此外，治療終點時，CJ016各劑量組裸鼠體重稱量結果較空白對照組下降值比紫杉醇組要小，實驗過程中裸鼠體重相對穩定。

Tab 1 Effects of CJ016 on cell proliferation

Fig 1 Effects of CJ016 on growth of A549 cell transplantation tumor

1:Control,2:PTX(20 mg·kg-1),3:CJ016(5 mg·kg-1),4:CJ016(10 mg·kg-1),5:CJ016(20 mg·kg-1).**P<0.01vscontrol

Fig 2 The immunohistochemical results of CJ016 on tumor(10×)

A:CD31;B: Apoptosis.1:Control,2:PTX(20 mg·kg-1),3:CJ016(5 mg·kg-1),4:CJ016(10 mg·kg-1),5:CJ016(20 mg·kg-1)

GroupDose/mg·kg-1Bodyweight/gBeginEndTumorvolume/mm3BeginEndT/C%Tumorweight/gInhibition/%Control———19.62±1.1022.01±1.61133.72±24.251766.15±466.52———1.22±0.33———Paclitaxel2020.21±1.0117.16±2.01136.81±11.42524.36±186.44**28.610.37±0.09**69.54CJ016519.82±1.3219.91±1.46135.66±27.74813.57±356.22**37.630.62±0.13**49.181020.22±0.9420.01±1.41141.21±17.43739.23±378.89**33.160.54±0.09**55.602019.96±1.3619.34±1.70143.22±30.15497.18±199.07**27.750.37±0.11**70.08

**P<0.01vscontrol

2.3 免疫組化檢測結果 免疫組化檢測結果如Fig 2所示：治療終點時，CJ016各給藥組瘤體新生血管數目較空白對照組明顯減少(Fig 2A)，顯示出較好的抑制血管生成作用；同時，瘤體細胞凋亡數目與空白對照組比較明顯增加(Fig 2B)，說明CJ016對誘導腫瘤細胞凋亡有一定的促進作用。

3 討論

近年來，越來越多的努力已投入到HDAC抑制劑的開發中。目前，美國食品和藥品管理局(FDA)已批準4種HDAC抑制劑上市，分別是：Vorinostat(SAHA)、Romidepsin、Panobinostat(LBH589)和Belinostat；而我國自主知識產權的亞型選擇性HDAC抑制劑西達苯胺(chidamide)已在全球獲準上市[11]。這些HDAC抑制劑臨床上主要用于皮膚或外周T細胞淋巴瘤以及多發性骨髓瘤的治療，而對實體瘤的治療效果欠佳。為擴大HDAC抑制劑的抗瘤譜，本課題組合成了一系列新型HDAC抑制劑，并優化得到編號為CJ016的小分子化合物，旨在用于實體瘤治療[13]。體外研究表明(Tab 1)，CJ016對多株人源腫瘤細胞株增殖有明顯抑制作用，對多株肺癌細胞IC50檢測結果均小于0.25 μmol·L-1。因此，本文選取A549細胞株(IC50=34.22 nmol·L-1)建立裸鼠移植瘤模型，探討其體內抗腫瘤活性和可能的作用靶點。

HDAC抑制劑能通過調節表觀遺傳學與蛋白質的翻譯后修飾，影響細胞基因表達和蛋白質的功能，從而導致腫瘤細胞分化、衰老、生長停滯以及凋亡，并抑制血管生成。不同的HDAC抑制劑由于分子特征、選擇性、作用濃度和時間不同，其抗腫瘤的機制也會有差異。目前，已報道的文獻指出，HDAC抑制劑能夠抑制腫瘤細胞微環境內血管的生成、誘導腫瘤細胞周期阻滯和凋亡，同時也可直接作用非組蛋白，影響其乙酰化狀態，調節多種基因的表達，從而發揮抗腫瘤活性。此外，越來越多的證據表明，HDAC抑制劑可通過直接影響惡性腫瘤細胞使其成為更有吸引力的免疫靶標，一定程度上加強宿主自身抗腫瘤免疫能力[14]。實驗結果表明(Fig 1、Tab 2)，CJ016對A549荷瘤小鼠腫瘤生長有明顯抑制作用，20 mg·kg-1劑量時抑瘤率達70.08%(P<0.01)。免疫組化結果顯示(Fig 2)，CJ016各給藥組腫瘤細胞CD31表達明顯減少，其對瘤體周圍血管生成有明顯抑制作用；同時，瘤體細胞凋亡發生明顯增加，腫瘤細胞增殖被有效抑制，共同起到抑制腫瘤細胞生長的作用。然而，CJ016抑制瘤體內血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡可能的分子機制有待進一步研究。

細胞的凋亡途徑主要包括死亡受體(細胞外)途徑和線粒體(細胞內)途徑，這兩個途徑均會誘導Caspase級聯反應。大量的研究表明，HDAC抑制劑可激活多種腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員及其配體的轉錄，同時還能影響Bcl-2家族基因表達和蛋白質的活性。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bim、Bmf、Bid等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1等)。Bcl-2家族基因轉錄及蛋白質的活性在線粒體凋亡途徑中起著重要作用[15]。因此，本課題組后續研究將圍繞CJ016對Caspase家族和Bcl-2家族相關蛋白的影響展開進一步研究，以期更好地闡明其抑瘤機制。此外，裸鼠體重稱量結果顯示(Tab 2)，治療終點時，陽性藥紫杉醇組裸鼠體重較分組時明顯減少，而CJ016各給藥組裸鼠體重基本保持恒定，說明其在藥物刺激性和毒性反應上具有優勢。綜上，CJ016在治療肺癌方面效果較為明顯，且進入體內后未見明顯的不良反應，其低毒、安全、有效的特點，頗具進一步開發的價值。

(致謝：感謝四川大學生物治療國家重點實驗室葉昊宇老師在移植瘤裸鼠模型建立及實驗過程中的悉心指導和幫助，并提供動物飼養場所。)

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Study of CJ016 in treatment of lung cancer

GAN Ping,TAN Yong-hong,JIN Wei-hua, WANG Ling-jie,YU Bo-tao

(DeptofPharmacy,GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083,China)

Aim To study the therapeutic effect of CJ016 on human lung cancer model and the mechanism.Methods An experimental human lung adenocarcinoma model of A549 was set up to investigate the anti-tumor effect of CJ016, while the effect of angiogenesis and apoptosis in tumor were detected.ResultsInvitro,the cell proliferation was inhibited significantly by CJ016,and the value of IC50was 34.22 nmol·L-1.Invivo, the tumor inhibition rate and T/C% value were 70.08% and 27.75%, respectively, at the dose of 20 mg·kg-1.Meanwhile,CJ016 could reduce the expression of CD31 and promote the apoptosis of tumor cells.Conclusion CJ016 can inhibit the growth of A549 cells, and the possible mechanism may be related to the reduction of angiogenesis and inducing tumor cell apoptosis.

lung cancer; mechanism; CJ016; A549; IC50; CD31;apoptosis

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.036.html

2016-10-25,

2016-12-21

國家自然科學基金青年基金資助項目(No 81402493)

甘 萍(1987-)，女，碩士，藥劑師，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail：ganping_2007@163.com; 于波濤(1965-)，男，博士，主任藥師，通訊作者,E-mail：cj_yubotao@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.018

A

1001-1978(2017)03-0384-05

R-332；R329.25；R363-332；R73-352；R734.2；R916.4；R979.1