1-甲基乙內酰脲抑制家兔生長激素的分泌

龍 飛，趙曉春，梁慶模

(南華大學附屬第一醫院1.胃腸外科、2.乳甲外科，湖南 衡陽 421001)

1-甲基乙內酰脲抑制家兔生長激素的分泌

龍 飛1，趙曉春1，梁慶模2

(南華大學附屬第一醫院1.胃腸外科、2.乳甲外科，湖南 衡陽 421001)

目的 探索1-甲基乙內酰脲(1-methylhydantoin, MH)抑制家兔生長激素(growth hormone, GH)基礎分泌以及拮抗生長激素釋放激素促分泌的作用。方法 將36只家兔按給藥種類不同，隨機分為生理鹽水組(A組)、MH組(B組)、奧曲肽組(C組)、生長激素釋放激素組(D組)、生長激素釋放激素+MH組(E組)和生長激素釋放激素+奧曲肽組(F組)，每組6只。各組家兔均在注射藥物之前和之后5、15、30、45、60 min各采血1.0 mL，利用酶聯免疫吸附測定試劑盒檢測血清GH水平，同時，密切觀察各組家兔在注射相應藥物后的行為活動情況(1周)。結果 ①A組家兔各個時間點的GH水平無差異(P>0.05)；②與A組相比，B組和C組家兔GH水平明顯降低(P<0.05)，而D組家兔GH水平明顯升高(P<0.05)；③與D組相比，E組和F組家兔GH水平明顯降低(P<0.05)；④各組實驗家兔在靜脈注射相應藥物后，1周之內未觀察到明顯的毒副反應。結論 ① MH能抑制家兔GH的基礎分泌；②MH能拮抗生長激素釋放激素的促分泌作用。

1-甲基乙內酰脲；家兔；生長激素；生長激素釋放激素；生長抑素；生長抑素類似物；奧曲肽

天然的生長抑素(somatostatin, SST)半衰期極短(<3 min)，且缺乏特異性，限制了它的臨床應用。于是科學家們研發了一系列肽類生長抑素類似物(somatostatin analogues, SSTAs)，如奧曲肽(octreotide, SMS 201-995)、蘭瑞肽(lanretide, BIM 23014)、伐普肽(vapreotide, RC 160)及帕瑞肽(pasireotide, SOM-230)等。目前，肽類SSTAs已應用于急性胰腺炎、消化道瘺、消化道出血、肢端肥大癥、庫欣病等疾病的治療[1-3]，并且在神經內分泌腫瘤的診斷和治療中占據重要地位[4-5]。雖然人工合成的肽類SSTAs相對于天然的SST有了很大改進，但是它們在臨床應用中仍存在許多弊端，如僅限于注射給藥，受體亞型選擇性欠佳，很難滲透入血-腦屏障、血-視網膜屏障，具有免疫原性等。于是非肽類生長抑素類似物(non-peptide somatostatin analogues, NPSSTAs)應運而生。NPSSTAs為無氨基酸肽鏈結構的模擬肽化合物，可以通過與各型生長抑素受體結合而發揮類似于SST的生物學作用。1-甲基乙內酰脲(1-methylhydantoin, MH)是乙內酰脲類化合物中的一種，化學結構分析顯示其具有與某些NPSSTAs相似的空間結構。MH是否具有SST的生理功能，是否屬于NPSSTAs，值得深入研究。本實驗將探索MH抑制家兔生長激素(growth hormone, GH)基礎分泌以及拮抗生長激素釋放激素(GHRH)促分泌的作用，從而驗證MH具有SST的基本功能，為NPSSTAs的研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康♂新西蘭白兔36只，3月齡，體質量約2.5 kg，購自南華大學實驗動物學部，生產許可證號：SCXK(湘)2015-0002，使用許可證號：SYXK(湘)2010-0006。動物的飼養條件遵照《實驗動物飼養條例》，飼養于南華大學實驗動物學部，環境符合普通級國家標準，即溫度恒定為18℃～29℃，相對濕度為40%～70%，室內保持安靜、清潔、干燥和通風，光照模式為12 h的光/暗周期。實驗前，適應性喂養2周，采用全價顆粒飼料，每天定時、定量，上午、下午各1次，自由進水。所有實驗選在下午14 ∶00～16 ∶30進行，整個實驗過程中禁食禁水。

1.2 試劑與耗材 ①1-甲基乙內酰脲：Sigma公司，用無菌生理鹽水配制成濃度分別為50、100 g·L-1的1-甲基乙內酰脲溶液；②奧曲肽：Sigma公司，用無菌生理鹽水配制成濃度分別為5、10 mg·L-1的奧曲肽溶液；③人生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone, GHRH)：Sigma公司，用無菌生理鹽水配制成濃度分別為5、10 mg·L-1的人GHRH溶液；④無菌生理鹽水：湖南科倫制藥有限公司；⑤家兔GH酶聯免疫吸附測定試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司(Elabscience)提供(產品編號：E-EL-RB2030c)。

1.3 儀器 ①電子天平：北京賽多利斯(Sartorius)天平有限公司；②超純水器：上海同田生物技術股份有限公司；③恒溫箱：德國Eppendorf公司；④離心機：德國Eppendorf公司；⑤冰箱：中國海爾股份有限公司；⑥酶標生化多功能儀：美國BIO-TEK公司(型號：ECX808)；⑦高精度移液器：德國Eppendorf公司。

1.4 實驗分組 將36只家兔按給藥種類不同，隨機分為生理鹽水組(A組)、1-甲基乙內酰脲組(B組)、奧曲肽組(C組)、生長激素釋放激素組(D組)、生長激素釋放激素+1-甲基乙內酰脲組(E組)和生長激素釋放激素+奧曲肽組(F組)，共6組，每組6只。A組家兔予以生理鹽水2.0 mL靜脈注射，B組家兔予以50 g·L-1的1-甲基乙內酰脲溶液2.0 mL靜脈注射，C組家兔予以5 mg·L-1的奧曲肽溶液2.0 mL靜脈注射，D組家兔予以5 mg·L-1的人生長激素釋放激素溶液2.0 mL靜脈注射，E組家兔先后靜脈注射10 mg·L-1的人生長激素釋放激素溶液和100 g·L-1的1-甲基乙內酰脲溶液各1.0 mL，F組家兔先后靜脈注射10 mg·L-1的人生長激素釋放激素溶液和10 mg·L-1的奧曲肽溶液各1.0 mL。

1.5 實驗步驟 ① 采血：將家兔用兔籠固定，拔去兔耳中央動脈局部的被毛，酒精消毒，用手指輕彈兔耳，使動脈擴張充血；用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央動脈的末端，沿著與動脈平行的向心方向刺入動脈，即可見血液進入針管，迅速抽取血液1.0 mL，退針并立即壓迫止血。采血后，將家兔置于飼養籠，自由活動。血液標本置于1.5 mL的無菌EP管中使其自然凝固。② 給藥：采血后，各組家兔分別靜脈注射相應藥物。具體方法：采用家兔外耳緣靜脈注射給藥；注射前，先將家兔放入固定籠內固定好，拔去注射部位的被毛，用75%的酒精消毒，手指輕彈兔耳，使靜脈充盈；左手食指和中指夾住靜脈的近心端，拇指繃緊靜脈的遠心端，無名指及小指墊在下面，右手持注射器，盡量從靜脈的遠端刺入血管，回一下血，放松對耳根處血管的壓迫，移動拇指于針頭上以固定，放開食指、中指，將藥液緩慢注入；注射完畢，用棉簽壓住針眼，拔去針頭，繼續壓迫數分鐘。③ 采血：按前述方法分別于給藥后5、15、30、45、60 min各采血1.0 mL。④ 離心：全血標本室溫放置2 h后，于1 000×g離心20 min，取上清置于1.5 mL的無菌EP管中，并分裝保存于-20℃。⑤ 檢測：按家兔GH酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明檢測血清GH水平。⑥ OD值換算：使用curve expert 1.4專業曲線制作軟件，每個標準品的OD值減去空白孔值的OD后，以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線，并將樣品的OD值(減去空白孔后的OD值)代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度。根據實驗要求，標準曲線的相關系數r應大于0.99。⑦ 密切觀察各組家兔在注射相應藥物后的行為活動情況(1周)。

2 結果

2.1 標準品檢測結果 標準品的濃度與對應的OD值見Tab 1。根據標準品的濃度與對應的OD值，使用curve expert 1.4專業曲線制作軟件繪出標準曲線(Fig 1)，并求得標準曲線的擬合方程式：線性擬合y=a+bx，其中a=1.616 472 818 45，b=44.326 933 680 4，相關系數r=0.998 528 37>0.99，可信程度高，符合要求。

Tab 1 Concentrations of standard substance and corresponding OD values

Fig 1 The standard curve

2.2 樣品檢測結果 將樣品的OD值減去空白孔的OD值后，代入標準曲線的擬合方程式，利用curve expert 1.4軟件計算出樣品濃度。各組家兔各個時間點血清GH水平計量資料的統計結果見Tab 2。

GroupTime/min0515304560A3.97±0.464.05±0.423.96±0.353.92±0.353.84±0.304.01±0.29B3.78±0.182.89±0.20*#2.15±0.20*#2.10±0.20*#2.21±0.19*#3.06±0.19*#C3.86±0.162.62±0.13*#1.56±0.15*#2.18±0.17*#2.87±0.17*#3.54±0.14*#D4.06±0.386.78±0.66*13.67±0.83*10.28±0.98*5.54±0.53*4.10±0.45E3.94±0.225.24±0.31*#7.32±0.25*#5.64±0.28*#4.48±0.28*#3.31±0.19*#F3.82±0.234.80±0.26*#6.88±0.34*#5.76±0.30*#4.92±0.29*#3.84±0.25

*P<0.05vsgroup A；#P<0.05vsgroup D

2.3 A、B、C三組之間的比較 通過重復測量數據的方差分析以及單因素方差分析，結合Fig 2可知：①A組家兔各個時間點的GH水平無差異(P=0.943)，提示家兔的基礎GH水平在14 ∶00～16 ∶30這一時間段波動較小；②B組家兔在靜脈注射MH 100 mg后5、15、30、45、60 min，血清GH濃度均明顯低于同一時間點的A組(P<0.05)，提示MH對家兔GH的基礎分泌有抑制作用，并且100 mg的MH靜脈注射后5 min左右家兔血清GH水平開始下降，15 min～30 min達到低谷，其作用時間可能超過60 min；③C組家兔在靜脈注射奧曲肽10 μg后5、15、30、45、60 min，血清GH濃度均明顯低于同一時間點的A組(P<0.05)，從而驗證了奧曲肽對家兔GH基礎分泌的抑制作用；④B、C兩組之間無差異(P=0.999)，提示100 mg的MH和10 μg的奧曲肽對家兔GH基礎分泌的抑制效果相當。

Fig 2 Changes of rabbits’ serum GH concentration in group A, B and C over time

*P<0.05vsgroup A

2.4 A、D兩組之間的比較 通過重復測量數據的方差分析結合Fig 3可知：D組家兔在靜脈注射人GHRH 10 μg后5、15、30、45、60 min，血清GH濃度均明顯高于同一時間點的A組(P<0.05)，從而驗證了人GHRH對家兔GH分泌的促進作用，10 μg的人GHRH靜脈注射后5 min左右家兔血清GH水平開始升高，15 min左右達到高峰，其作用時間可維持60 min左右。

Fig 3 Changes of rabbit serum GH concentration in group A and D over time

*P<0.05vsgroup A

2.5 D、E、F三組之間的比較 通過重復測量數據的方差分析結合Fig 4可知：① E組家兔在先后靜脈注射人GHRH 10 μg和MH 100 mg后5、15、30、45、60 min，血清GH濃度均明顯低于同一時間點的D組(P<0.05)，提示MH能拮抗人GHRH的促分泌作用；②F組家兔在先后靜脈注射GHRH 10 μg和奧曲肽10 μg后5、15、30、45 min，血清GH濃度均明顯低于同一時間點的D組(P<0.05)，從而驗證了奧曲肽對人GHRH的拮抗作用；③E、F兩組之間無差異(P=1.000)，提示100 mg的1-甲基乙內酰脲和10 μg的奧曲肽對人GHRH的拮抗作用相當。

2.6 各組家兔在注射相應藥物后的行為活動情況 各組家兔在靜脈注射相應藥物后，1周之內未出現死亡，也未觀察到明顯的行為活動異常，如撕咬、尖叫、攻擊行為等，無明顯的進食、飲水異常，無嘔吐、腹瀉及煩躁不安，無大小便異常及眼鼻異常分泌物等。

Fig 4 Changes of rabbit serum GH concentration in group D, E and F over time

#P<0.05vsgroup D

3 討論

3.1 乙內酰脲類化合物 乙內酰脲(hydantoin)是一種五元雜環化合物，化學名為2,4-咪唑烷二酮(2,4-imidazolidinedione)。除了C2和C4上的羰基，乙內酰脲雜環上的C5、N1和N3均可連接不同的取代基，從而形成各種乙內酰脲的衍生物，并產生不同的理化特性和藥理作用。但目前除了鹵代乙內酰脲類化合物應用于消毒殺菌和苯基乙內酰脲類化合物用于抗驚厥和心律失常外，大部分乙內酰脲類化合物的藥理作用(如消除活性氧和自由基、降低血糖、阻滯鈉離子通道、抑制尿毒癥毒素的產生以及抗炎、抗腫瘤等)還處于研究階段[6]。1-甲基乙內酰脲是乙內酰脲類化合物中的一種，又稱為1-甲基海因，其分子質量小、結構簡單[7-9]、原料價廉易得、合成方法簡便[9]，并且口服生物利用度高、透膜性強、毒性極低、符合口服藥物標準[10]。此外研究還顯示，1-甲基乙內酰脲可能具有抗炎[11]、消除活性氧和自由基[12-14]、抗腫瘤[15-18]、止咳平喘[11,19]、抗抑郁[20]等藥理作用。故將其作為一種新藥進行研發，有廣闊的應用前景。

3.2 1-甲基乙內酰脲可能是一種新型的非肽類生長抑素類似物 近幾年來，本課題組一直致力于MH及NPSSTAs的研究，尤其是探索二者之間的關系。我們通過分子結構分析了解到MH具有與某些NPSSTAs相似的化學基團。例如，美國佛羅里達州阿拉楚阿市RFE制藥公司合成的SCR007就是一種咪唑烷二酮(imidazolidinedione)衍生物，同時也是一種高選擇性作用于生長抑素2型受體的非肽類生長抑素受體激動劑，具有很好的鎮痛作用[21]；2007年發布的專利號為US7189856的一種NPSSTA的核心結構為乙內酰脲，故屬于乙內酰脲類化合物，可選擇性作用于生長抑素2型受體[22]。基于以上事實，我們猜測MH可能也是一種非肽類生長抑素受體配體。為了證實這一猜想，我們研究了MH對SD大鼠生長激素水平的影響，發現MH能降低苯巴比妥造模大鼠生長激素的水平[23]，提示其可能具有生長抑素的功能，但有必要通過更加完善及有說服力的實驗予以進一步證實。

在本實驗中，靜脈注射MH或奧曲肽后，家兔的GH水平明顯降低，提示MH和奧曲肽對家兔GH的分泌均有抑制作用；靜脈注射人GHRH后，家兔的GH水平明顯升高，提示人GHRH對家兔GH的分泌有促進作用；靜脈注射GHRH后立即注射MH或奧曲肽，家兔GH水平的升高幅度明顯下降，提示MH和奧曲肽對GHRH均有拮抗作用。此外，本實驗還發現：①家兔的GH基礎水平在14 ∶00～16 ∶30這一時間段波動較小；②100 mg的MH靜脈注射后5 min左右家兔GH水平開始下降，15～30 min達到低谷，其作用時間可能超過60 min。這些實驗結果證實了MH對家兔GH分泌的抑制作用以及對GHRH的拮抗作用，表明MH具有生長抑素及其類似物最基本的功能，可能是一種新型的NPSSTA。

3.3 1-甲基乙內酰脲與奧曲肽的作用效果比較 目前，關于MH的藥理作用(如止咳平喘、抗抑郁等)的研究主要使用大鼠作為研究對象，給藥途徑一般是灌胃，劑量通常為10～200 mg·kg-1不等[19-20]。Ienaga等[24]研究MH在哺乳動物中的代謝途徑時發現，給大鼠一次性口服50 mg·kg-1的MH后，大約15 min達到最大血藥濃度，Cmax=44.7 mg·L-1。由此可以推測，當MH的血藥濃度達到44.7 mg·L-1時足以發揮止咳平喘、抗抑郁等藥理作用。本實驗因為要反復多次采血檢測血清GH水平，故選擇了同為哺乳動物且更大型的家兔作為研究對象，同時，為了便于與奧曲肽對比作用效果，給藥途徑采用靜脈注射。家兔的血容量約為45～70 mL·kg-1，本實驗家兔體質量約2.5 kg，若要達到上述血藥濃度，則靜脈給藥量需要5.0～7.8 mg。故在預實驗中，我們設定了3個劑量組：低劑量組(1.0 mg，MH)、中劑量組(10 mg，MH)和高劑量組(100 mg，MH)。結果發現：與對照組(生理鹽水)相比，低、中、高劑量組家兔血清GH濃度均明顯降低(P<0.05)，且下降水平高劑量組>中劑量組>低劑量組(P<0.05)，提示MH對家兔GH的分泌有抑制作用，并且在1.0～100 mg有劑量依賴性，劑量越大抑制作用越強、越持久。奧曲肽是一種人工合成的八肽環狀化合物。作為最經典的SSTAs，奧曲肽具有與內源性SST相似的作用，但作用更強且持久，其半衰期較天然的SST長30倍。目前，奧曲肽已廣泛用于急性胰腺炎、消化道瘺、消化道出血、肢端肥大癥、庫欣病、神經內分泌腫瘤等疾病的治療，并取得較好的效果。但奧曲肽作為一種肽類SSTAs，在臨床應用中仍存在一些弊端，如僅限于注射給藥，受體亞型選擇性欠佳，很難滲透入血-腦屏障、血-視網膜屏障，并且具有免疫原性。而NPSSTAs也許能彌補這些不足。

在本實驗中，B組和C組以及E組和F組家兔GH水平的差異無統計學意義(P>0.05)，提示100 mg的MH和10 μg的奧曲肽對家兔GH基礎分泌的抑制效果和對GHRH的拮抗作用相當。但由于缺乏統一的比較標準，尚不能認定MH和奧曲肽的作用效果孰強孰弱。二者的作用效果比較有待進一步研究。但既然實驗結果提示MH可能屬于NPSSTAs，倘若又能證實其作用效果與奧曲肽相當，則MH將發揮其口服生物利用度高、半衰期長、選擇性強、透膜性好、無免疫原性等優點，可能取代奧曲肽而應用于急性胰腺炎、消化道瘺、消化道出血、肢端肥大癥、庫欣病、神經內分泌腫瘤等疾病的治療。

3.4 1-甲基乙內酰脲的毒副作用 幾乎所有的藥物都可能出現不良反應，只是反應的程度和發生率不一樣。藥物的毒副作用可能制約其臨床應用范圍及療程，并影響其最大療效的發揮。所以，研發毒副反應小的藥物對疾病的治療至關重要。有報道稱MH的毒性極低[10]。在本實驗中，家兔在靜脈注射100 mg的MH后，1周之內未出現死亡，也未觀察到明顯的行為活動異常，如撕咬、尖叫、攻擊行為等，無明顯的進食、飲水異常，無嘔吐、腹瀉及煩躁不安，無大小便異常及眼鼻異常分泌物等，也表明MH的毒副反應較輕。但這僅限于1周的行為活動觀察，尚需進行更長時間的觀察及相應的實驗室檢測(如肝腎功能等)，并且可以考慮通過胃飼加大劑量，以進一步研究MH的作用效果及毒副作用。

3.5 本實驗的意義與展望 綜上所述，MH具有生長抑素及其類似物最基本的功能，可能是一種新型的NPSSTA，并具有廣闊的應用前景。目前，國外仍在不斷開發新型、高效的NPSSTAs，但尚無關于MH作為NPSSTAs的文獻報道，而國內在這一領域更是空白。故本實驗為NPSSTAs的研發提供了新的方向，但尚需通過其他實驗(如受體結合分析、功能實驗等)進一步證實。此外，關于MH的藥代動力學和毒理學尚不明確，其抑制GH分泌的作用機制尚需進一步研究，并且是否存在其他更好的具有生長抑素功能的乙內酰脲類化合物也是我們要繼續探索的方向。

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1-methylhydantoin inhibits secretion of growth hormone in rabbits

LONG Fei1, ZHAO Xiao-chun1, LIANG Qing-mo2

(1.DeptofGastrointestinalSurgery,2.DeptofBreastandThyroidSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Aim To explore whether 1-methylhydantoin(MH) could inhibit the basal secretion of growth hormone(GH) and suppress the promoting effect of growth hormone-releasing hormone(GHRH) in rabbits. Methods Thirty-six rabbits were randomly divided into six experimental groups according to the kind of dosing drugs, namely normal saline group(A), MH group(B), octreotide group(C), GHRH group(D), GHRH + MH group(E), GHRH + octreotide group(F), with 6 rabbits in each group. Blood was sampled (1.0 mL each time) from each rabbit before injecting drugs and 5, 15, 30, 45, 60 min after drug administration. Clotting spontaneously, rabbits blood samples were centrifugated for 20 minutes at approximately 1 000×gand the supernatant was collected. Serum GH concentrations were determined by enzyme linked immunosorbent assay kit(ELISA Kit). Meanwhile, the behavior of rabbits in each group after injecting drugs was closely observed. Results The GH level of rabbits in group A at each time point had no significant differences(P>0.05). Group B and group C rabbit GH levels were significantly lower than those of group A(P<0.05), while GH levels in group D were obviously higher than those of group A(P<0.05). Compared with group D, rabbit GH levels in group E and group F decreased markedly(P<0.05). No obvious toxic and side effects had been observed within one week after the experimental rabbits were administered corresponding drugs by intravenous injection. Conclusions 1-methylhydantoin could inhibit the basal secretion of GH in rabbits. 1-methylhydantoin could suppress the promoting effect of GHRH in rabbits.

1-methylhydantoin; rabbits; growth hormone; growth hormone-releasing hormone; somatostatin; somatostatin analogues;octreotide

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.042.html

2016-11-16，

2016-12-17

湖南省自然科學基金資助項目(No 12JJ9030)

龍 飛(1989- )，男，碩士生，住院醫師,研究方向：非肽類生長抑素類似物的研發,Tel：0734-8578608,E-mail：984210652@qq.com; 梁慶模(1956- )，男，教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向：非肽類生長抑素類似物的研發，通訊作者， Tel：0734-8578566，E-mail：642286498@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.021

A

1001-1978(2017)03-0401-06

R-332；R979.1