斑貞1號聯(lián)合TMP、5—FU對人胃癌細胞CDX2基因表達影響

張愛民+郭元虎+郝旺勝+馬振華

[摘要] 目的 探討斑貞1號聯(lián)合TMP、5-FU逆轉(zhuǎn)人胃癌細胞系SGC-7901/ADR與CDX2相關(guān)性。 方法 從2015年6—12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室進行SGC7-901/ADR細胞培養(yǎng)，設(shè)①空白對照組、②5-FU組、③斑貞1號組、④5-FU+斑貞1號組、⑤5-FU+斑貞1號+ TMP組觀察細胞毒性，選取各個藥物組作用濃度分別提取總mRNA，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）監(jiān)測人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在不同藥物組的尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）mRNA的表達情況。結(jié)果 對照組CDX2 mRNA 表達量為（2.01±0.26），5-FU組CDX2mRNA表達量為（1.94±0.24），5-FU組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而5-FU聯(lián)合斑貞1號及TMP處理組CDX2 mRNA表達量為（0.44±0.07），與其他組明顯降低比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 斑貞1號聯(lián)合TMP及5-FU逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901/ADR細胞耐藥性可能與CDX2基因相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；斑貞1號；TMP； 5-FU； 多藥耐藥；CDX2基因

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（a）-0032-04

在我國，胃癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤前3[1]，手術(shù)治療一直是胃癌的首選治療手段，但除日本外的大多數(shù)國家早期診斷率較低，因此根治手術(shù)率仍然較低，化療在胃癌治療中顯得十分重要，但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）在胃癌細胞的多藥耐藥性調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。侯培珍[2]研究結(jié)果示斑貞1號、5-FU 和TMP聯(lián)合對人胃癌SGC-7901/ADR細胞有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。該實驗從2015年6—12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室進行SGC7-901/ADR細胞培養(yǎng)，采用RT-PCR比較人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在不同藥物組CDX2mRNA的表達量，進一步探討斑貞1號 + 5-FU+TMP對人胃癌SGC-7901/ADR細胞的作用機理，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

細胞系胃癌SGC-7901/ADR細胞（人胃癌細胞）。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

自擬“斑貞1號”每mL含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU （規(guī)格10 mL：0.25 g，國藥準字H310 20593）、TMP（規(guī)格40 mg，國藥準字H20031302）、RPMI1640培養(yǎng)基（RPMI是Roswell Park Memorial Institute的縮寫，1640是培養(yǎng)基代號）。其中含有10%胎牛血清，二甲基亞砜、胰蛋白酶，新生小牛血清兩步法RT-PCR試劑盒，Trizol，引物，PCR擴增儀、電泳儀（DF-D）、紫外分光度計、紫外透視成像系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞處理 以5×104/mL接種于6孔板上，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，實驗孔依次加入等量的新的培養(yǎng)液； 5-FU稀釋液；斑貞1號稀釋液；斑貞1號 + 5-FU稀釋液；斑貞1號 + 5-FU+TMP稀釋液（選取各自的IC50值）。培養(yǎng)48 h后，PBS緩沖液沖洗，準備提取總mRNA。

1.3.2 RT- PCR檢測 以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 每個反應(yīng)體系25 uL，目的基因引物各0.5 uL，Takara Taq 1 uL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus） 2.5 uL，dNTP Mixture 2 uL，ddH2O 13.5 uL；各樣品cDNA5 uL，β -action的正義列為5'-AGAGCGGCATGAAGAAGGAGTG-3'，反義列為5ˊ-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，CDX2基因序列的正義列引5-TCAGACCTACGCCGAATATGC-3，反義列引物為5'-GAAATGGGAGAAGGTAGTGTCAAA-3'，滅菌蒸餾水13.5 uL。預(yù)變性→變性→退火→延伸條件分別是、98℃、2～4 min→98℃、8 s→55℃、12 s→72℃、55 s，共30個循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min。擴增結(jié)束，取樣品10 uL，經(jīng)100 V恒壓，2%瓊脂糖電泳60 min，采集電泳圖像，凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描得出各電泳帶光密度值（即目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值）。

1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用LSD t檢驗， P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC7901/ADR細胞經(jīng)不同藥物處理后CDX2 mRNA的表達

5-FU組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。其他藥物組與對照組及組間比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離的表達

CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于247bp和548bp。A、B、C、D、E為CDX2表達，A1、B1、C1、D1、E1為β-action的表達。

3 討論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一，至今為止手術(shù)仍是胃癌的主要治療方法。因早癌診斷率低，多數(shù)患者失去手術(shù)機會，所以化療在胃癌治療中顯得十分重要，但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性（MDR），郝旺勝等[3]研究發(fā)現(xiàn)人胃癌SGC-7901/ADR細胞對5-FU相對耐藥性為97.49%；有日本學(xué)者[4-5]發(fā)現(xiàn) CDX2 是腫瘤多藥耐藥性重要控制基因 MDR1 的直接上游基因通過構(gòu)建 CDX2 沉默的病毒載體轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性增加，將藥物泵出細胞的效率降低，胃癌細胞株的凋亡增加，并促使胃癌細胞停滯于 M 期；儲婧等[6]研究發(fā)現(xiàn)CDX2和腸型claudin- 3胃黏膜腸化生及腸型胃癌中表達具有相關(guān)性， Bae等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CDX2 的表達與結(jié)腸、直腸癌密切相關(guān)，且可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后評估指標。Bonhomme 等[8]研究表明CDX2在結(jié)直腸癌組織中呈低表達， 能抑制腫瘤的發(fā)生且CDX2表達的減少與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良有關(guān)，Hong KD等[9-10] CDX2在結(jié)直腸癌中表達研究的分析結(jié)果，在高中分化癌組織中的表達明顯高于在低分化癌組織中的表達。肖燾等[11]研究發(fā)現(xiàn) C D X2屬于腸道特異性的核轉(zhuǎn)錄因子， 對腸上皮細胞正常形態(tài)和功能維持起一定的作用基因長度22～23 KB，由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成，參與腸道發(fā)育過程多個步驟調(diào)節(jié)，主要有細胞增殖、分化、遷移及惡變，在早期腸分化中起重要作用[12]；在正常狀態(tài)下其表達難以測定，但在內(nèi)毒素、細胞因子、癌基因等多種刺激因子下，可明顯表達[13-14]。CDX2促進腫瘤發(fā)生的機制主要是誘導(dǎo)細胞增殖、促進腫瘤新生血管的生成，同時抑制機體抗腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)[15-16]，斑貞1號合劑（斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸），主要斑蝥素主要是抑制腫瘤細胞核苷酸合成，起到解毒殺瘤、殺傷腫瘤同時無骨髓抑制作用。女貞子對染色體損傷具保護作用。TMP可通過多種途徑，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，對腫瘤起到治療作用。楊葉等[17]研究已證實TMP能顯著增加SGC-7901/ADR細胞對5-FU的敏感性；斑貞1號和TMP聯(lián)合5-FU對人胃癌細胞有較強的逆轉(zhuǎn)作用。該研究顯示對照組CDX2 mRNA 表達量為（2.01±0.26），5-FU組CDX2mRNA表達量為（1.94±0.24），5-FU組與對照組比較COX-2mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明COX-2參與耐藥細胞對5-FU的耐藥性。斑貞1號和TMP聯(lián)合5-FU組COX-2mRNA表達量為（0.44±0.07），明顯低于其他用藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明可顯著抑制耐藥細胞COX-2mRNA的高表達，克服了由COX-2基因介導(dǎo)的多藥耐藥性，增強了治療效果。

綜上所述，斑貞1號聯(lián)合TMP及5-FU可以逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901/ADR細胞耐藥性，并初步探討其影響人胃癌耐藥細胞株的分子機制，為胃癌耐藥性逆轉(zhuǎn)的基因治療打下理論基礎(chǔ)，值得推廣，體外試驗結(jié)果在體內(nèi)是否能發(fā)揮相同的作用，有待于進一步的研究和探討。如果實驗條件允許，不僅局限于CDX2的研究，可以進行多基因研究，此外選用實時熒光定量PCR實驗就會更加完美。

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（收稿日期：2016-10-09）