聯合免疫熒光和熒光原位雜交法檢測TNFAIP3基因在結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的異常及意義

劉 芳，王映梅,2，李明陽，趙丹暉,2，李 俠,2，劉一雄，王 哲,2，閆慶國,2

結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤是一種起源于成熟NK細胞和NK樣T細胞的侵襲性淋巴瘤，以瘤細胞顯著壞死、嗜血管分布和細胞毒性表型為特征[1]。該腫瘤的5年生存率在不同研究隊列中差異較大，總體預后不佳。因此，了解影響該腫瘤預后的分子機制，對指導治療、預測預后、提高患者生存率有著重要的意義。研究表明，NF-κB信號通路對多種淋巴瘤的預后有顯著影響[2]，TNFAIP3基因編碼的A20蛋白是NF-κB信號通路全面的負性調節分子[3]。而TNFAIP3是否與結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤的預后有關尚未見相關報道。結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤的組織炎細胞背景明顯，單純熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術在暗視野下不能區分炎細胞與腫瘤細胞，易造成結果偏差。聯合免疫熒光和熒光原位雜交(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasm, FICTION)法是一種將免疫熒光與熒光原位雜交結合的實驗技術，可用抗體標記腫瘤細胞，彌補FISH技術在暗視野下不能識別腫瘤細胞的缺陷。本實驗應用FICTION技術檢測結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中TNFAIP3基因的異常，探討TNFAIP3基因異常與患者臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1材料收集2010～2015年第四軍醫大學附屬西京醫院病理科診治的結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤病例，選取腫瘤組織所占比例≥30%的109例納入本實驗。收集患者臨床資料與組織蠟塊。

1.2FICTION檢測TNFAIP3基因紅色探針(BAC克隆號RP11-771C9和RP11-953L22，覆蓋該基因全部區段)及6號染色體著絲粒綠色探針由廣州安必平公司協助標記。組織切片經常規脫蠟；EDTA(pH 8.0)高壓抗原修復3 min；CD56抗體(Clone 56C04)孵育4 ℃過夜，復溫后TBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；避光孵育綠色熒光二抗45 min，TBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；在梯度乙醇溶液中洗滌脫水，空氣中晾干；TNFAIP3探針雜交，85 ℃變性5 min，37 ℃雜交20 h；37 ℃雜交洗液2×SSC洗滌2次，每次10 min，0.1%NP-40/2×SSC溶液洗滌1次，5 min；以DAPI進行核復染；經熒光顯微鏡成像及分析。分別統計每例CD56陽性和陰性細胞中紅色信號數和綠色信號數，以紅色信號數少于綠色信號數的細胞為TNFAIP3缺失細胞，并計算每例中50個CD56陽性和陰性細胞缺失細胞所占比例。以CD56陰性細胞為陰性對照，其缺失細胞的百分比值符合正態分布，以其均數加上2倍標準差為判斷病例存在基因缺失的cutoff值，結果為42%，即CD56陽性結果中缺失細胞所占比例>42%時，認為此病例為TNFAIP3缺失。

1.3統計學分析應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，CD56陰性細胞中缺失細胞所占百分比值的正態性檢驗采用矩法計算。TNFAIP3基因缺失與臨床病理特征的相關性分析采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1臨床特征腫瘤以瘤細胞顯著壞死、嗜血管分布為特征，所有病例EBER原位雜交檢測均呈陽性(圖1)。109例結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中男性89例，女性20例；年齡范圍10～81歲(中位年齡42歲)；97例腫瘤原發于鼻部及其臨近結構，7例原發于小腸，4例原發于扁桃體，1例原發于下肢。Ⅲ+Ⅳ期病例占26.0%(18/69)。42.3%(25/60)患者乳酸脫氫酶水平升高。根據國際預后指數(international prognostic index, IPI)的風險評估結果如下：低風險組48例(48/69，69.6%)，中低風險組17例(17/69，24.6%)，中高風險組3例(3/69，4.3%)，高風險組1例(1/71，1.4%)。因醫院病理庫中收錄的部分患者未在西京醫院治療，故患者Ann Arbor分期、B癥狀、IPI指數及血清乳酸脫氫酶水平指標的收集不足109例。

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圖1結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤的病理改變：A.瘤細胞壞死明顯，具有異型性；B.腫瘤細胞EBER原位雜交檢測陽性

2.2結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中TNFAIP3基因缺失及其與臨床病理特征的關系在正常扁桃體組織進行TNFAIP3探針檢測，細胞中綠色6號著絲粒染色體信號與紅色TNFAIP3信號比例相等(圖2A)，主要為細胞內2紅/2綠信號，證明TNFAIP3探針研發成功。在結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中行FICTION檢測，CD56抗體明確區分腫瘤細胞與非腫瘤細胞(圖2B)。FICTION共成功檢測79例結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤，其中25例(25/79，32.1%)存在TNFAIP3基因缺失。TNFAIP3缺失與患者性別、年齡、B癥狀、腫瘤分期、乳酸脫氫酶水平無明星相關性(P均>0.05)，與IPI指數呈明顯負相關(P=0.190，表1)。

AB

圖2TNFAIP3缺失檢測，紅色探針信號代表TNFAIP3基因，綠色探針信號代表6號染色體著絲粒，綠色細胞膜染色信號代表CD56陽性：A.正常扁桃體，TNFAIP3基因正常，細胞為2紅/2綠信號；B.CD56細胞質陽性細胞，TNFAIP3基因缺失，表現為1紅/2綠信號

表1 TNFAIP3基因缺失與結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤臨床病理特征的關系

*P<0.05

3 討論

結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤是一種高度侵襲性腫瘤，在中國人群中發病率僅次于成熟B細胞淋巴瘤[4]。其臨床進展快、遠期預后差，并且目前無特效的分子靶向藥物應用于臨床。Yoon等[5]用放療結合MIDLE方案(甲氨蝶呤、依托泊苷、異環磷酰胺、地塞米松、L-天冬酰胺酶)化療法，患者3年生存率達81.5%。Michot等[6]應用放療聯合ESHAP方案(依托泊苷、類固醇、高劑量阿糖胞苷、鉑類)化療，使患者2年生存率達72%。但是2014年Kim等[7]的研究雖然加用了L-天冬酰胺酶的治療，患者5年生存率僅60%。Kwong等[8]報道87例亞洲NK/T細胞淋巴瘤患者的5年生存率為50%，并且作者強調IPI是影響患者預后與生存最重要的因素。Yu等[9]對115例中國結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤進行研究，發現其5年生存率僅48.7%。對于患者的預后，不同的研究差異如此明顯，故了解影響該腫瘤預后的分子機制，對指導治療、預測預后、提高患者生存率有著重要的意義。

研究表明，NF-κB信號通路對多種淋巴瘤的預后有顯著影響。NF-κB信號通路活化的外周T細胞淋巴瘤患者的生存時間長于非活化組，并且NF-κB信號通路活化可以作為獨立的預后因素，與總體生存顯著相關[10]。同時在彌漫大B細胞淋巴瘤的研究中也得出相同結論[11]。Chien等[12]在小鼠成瘤模型和細胞系中證實NF-κB信號通路活化可以促進細胞衰老，提高腫瘤對化療的敏感性。

A20對NF-κB信號通路有全面抑制作用，但是TNFAIP3對結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤的預后是否有影響尚未見相關報道。A20蛋白具有泛素修飾酶的活性，可以去掉RIP1分子63位賴氨酸的多泛素化鏈，同時給48位賴氨酸加上一個多泛素化鏈，使得RIP1分子被蛋白酶體水解，從而不能活化IKK分子。IKK分子是NF-κB信號通路的重要調節分子，可以直接磷酸化與NF-κB分子結合的IκBα，使得IκBα被蛋白酶體降解，從而釋放NF-κB分子進入核內與DNA上特定位點結合，發揮調節細胞功能的作用[13]。若無A20蛋白，RIP1分子便可以活化IKK分子，進而使得NF-κB信號通路活化。TNFAIP3基因位于6q23-25，6q21-25是結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤最常發生缺失的區域[14]。然而針對TNFAIP3在結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的研究尚未見相關報道。

本組實驗發現，32.1%(25/79)的病例存在TNFAIP3基因缺失，進一步分析TNFAIP3基因缺失與患者臨床病理特征的關系發現，TNFAIP3基因缺失與患者的IPI呈負相關，且差異有統計學意義，TNFAIP3基因缺失與患者Ann Arbor分期雖然無統計學意義，但TNFAIP3基因缺失患者傾向于呈現較低分期，提示TNFAIP3基因缺失可能是影響患者預后的關鍵因素。研究應用免疫熒光與熒光原位雜交結合的實驗技術FICTION，以CD56抗體標記腫瘤細胞，從而可以在暗視野下區分腫瘤細胞核與非腫瘤細胞核。這一實驗技術被廣泛運用到淋巴瘤細胞及骨髓細胞的基因異常檢測中。Nomoto等[15]運用FICTION技術成功在霍奇金淋巴瘤中檢測到腫瘤細胞的TNFAIP3缺失。Martinez-Ramirez等[16]針對FICTION技術的關鍵步驟-抗原修復，設置不同條件，探索出最佳修復時間和修復液酸堿度，同時作者認為該技術在石蠟組織的腫瘤診斷，尤其是構成復雜的腫瘤中存在巨大優勢。

本組實驗發現，結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中存在高比例的TNFAIP3缺失，且TNFAIP3缺失與IPI指數顯著相關，提示TNFAIP3缺失是影響結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤患者預后的關鍵因素。對于NF-κB信號通路在結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤中的活化情況，仍需深入研究，以進一步闡明腫瘤預后的影響因素。

[1] 陳定寶, 王 穎, 宋秋靜, 等. 結外鼻型NK/T細胞淋巴瘤28例臨床病理分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(4):404-408.

[2] Perkins N D. The diverse and complex roles of NF-κB subunits in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2012,12(2):121-132.

[3] Verstrepen L, Verhelst K, van Loo G,etal. Expression, biological activities and mechanisms of action of A20 (TNFAIP3)[J]. Biochem Pharmacol, 2010,80(12):2009-2020.

[4] 王曉卿, 徐 鋼, 李 娟, 等. 淋巴瘤589例構成分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2011,27(12):1356-1358.

[5] Yoon D H, Kim S J, Jeong S H,etal. Phase II trial of concurrent chemoradiotherapy with L-asparaginase and MIDLE chemotherapy for newly diagnosed stage I/II extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type (CISL-1008)[J]. Oncotarget, 2016,7(51):85584-85591.

[6] Michot J M, Mazeron R, Danu A,etal. Concurrent etoposide, steroid, high-dose ara-c and platinum chemotherapy with radiation therapy in localised extranodal natural killer (NK)/T-cell lymphoma, nasal type[J]. Eur J Cancer, 2015,51(16):2386-2395.

[7] Kim S J, Yang D H, Kim J S,etal. Concurrent chemoradiotherapy followed by L-asparaginase-containing chemotherapy, VIDL, for localized nasal extranodal NK/T cell lymphoma: CISL08-01 phase II study[J]. Ann Hematol, 2014,93(11):1895-1901.

[8] Kwong Y L, Kim W S, Lim S T,etal. SMILE for natural killer/T-cell lymphoma: analysis of safety and efficacy from the asia lymphoma study group[J]. Blood, 2012,120(15):2973-2980.

[9] Yu J B, Zuo Z, Zhang W Y,etal. Identification of immunophenotypic subtypes with different prognoses in extranodal natural killer/T-cell lymphoma, nasal type[J]. Hum Pathol, 2014,45(11):2255-2262.

[10] Martinez-Delgado B, Cuadros M, Honrado E,etal. Differential expression of NF-kappaB pathway genes among peripheral T-cell lymphomas[J]. Leukemia, 2005,19(12):2254-2263.

[11] Espinosa I, Briones J, Bordes R,etal. Activation of the NF-κB signalling pathway in diffuse large B-cell lymphoma: clinical implications[J]. Histopathology, 2008,53(4):441-449.

[12] Chien Y, Scuoppo C, Wang X,etal. Control of the senescence-associated secretory phenotype by NF-κB promotes senescence and enhances chemosensitivity[J]. Gene Dev, 2011,25(20):2125-2136.

[13] Yan Q, Huang Y, Watkins A J,etal. BCR and TLR signaling pathways are recurrently targeted by genetic changes in splenic marginal zone lymphomas[J]. Haematologica, 2012,97(4):595-598.

[14] Huang Y, de Leval L, Gaulard P. Molecular underpinning of extranodal NK/T-cell lymphoma[J]. Best Pract Res Clin Haematol, 2013,26(1):57-74.

[15] Nomoto J, Hiramoto N, Kato M,etal. Deletion of the TNFAIP3/A20gene detected by FICTION analysis in classical Hodgkin lymphoma[J]. BMC Cancer, 2012,12(1):457.

[16] Martinez-Ramirez A, Cigudosa J C, Maestre L,etal. Simultaneous detection of the immunophenotypic markers and genetic aberrations on routinely processed paraffin sections of lymphoma samples by means of the FICTION technique[J]. Leukemia, 2004,18(2):348-353.