Cyclin D1與claudin7聯合檢測在腎上皮性腫瘤鑒別診斷中的價值

劉 燕，趙 鵬，于文娟，王 強，陳云慶，鄒玉偉，李玉軍，張 偉

不同組織類型的腎腫瘤形態學上有重疊，彼此之間易混淆。研究表明，腎腫瘤的病理組織分型具有重要的預后意義[1-2]，因此準確的病理診斷及鑒別診斷非常重要。目前用于輔助診斷和鑒別診斷腎腫瘤的免疫組化抗體種類繁多，但特異性和敏感性報道不一，為進一步豐富腎腫瘤的免疫組化診斷譜，本實驗應用組織芯片及免疫組化技術檢測常見不同組織類型腎腫瘤中Cyclin D1和claudin7的表達，探討兩種抗體對腎腫瘤鑒別診斷的應用價值。

1 材料與方法

1.1病例來源收集青島大學附屬醫院和解放軍第401醫院2010年1月～2015年12月連續性腎腫瘤358例，所有病例均由兩名以上經驗豐富的病理專科醫師重新閱片，最終明確診斷、無異議的腎腫瘤326例，包括腎嗜酸細胞瘤(renal oncocytoma, RO)62例、透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, CCRCC)147例、嫌色細胞癌(chromophobe renal cell carcinoma, ChRCC)51例、乳頭狀腎癌(papillary renal cell carcinoma, PRCC)35例、透明細胞管狀乳頭狀腎癌(clear cell tubulopapillary renal cell carcinoma, CCTPRCC)16例和Xp11.2易位/TFE3基因融合相關性腎癌15例。另選取20例腫瘤旁腎組織作為對照，分析正常腎組織中兩種抗體的表達。

1.2方法對所有病例的HE切片進行形態學觀察，鏡下將所需的典型病變區域用油性筆標記，然后將該切片和石蠟組織塊進行比較，依靠HE切片上的標記在石蠟組織塊上的同一部位也做一標記；利用組織芯片制作儀(Tissue Arrayer，Beecher Instrument, USA)的鉆孔芯針在供體蠟塊穿取直徑為1.5 mm的組織芯，依次插入到受體蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。用切片機對組織芯片蠟塊3 μm厚連續切片，對組織微陣列中的每個組織片逐一在顯微鏡下進行仔細觀察與比對，結果成功構建309例，17例不合格標本被除外。空位Maker選用扁桃體組織，位于芯片的一角。

1.3免疫組化染色各組病例均行Cyclin D1(鼠抗人單克隆，SP4，1 ∶100，Spring公司)和claudin7(兔抗人多克隆，1 ∶200，Abcam公司)免疫組化染色，同批次設陽性對照和陰性對照。免疫組化染色采用EnVision兩步法，在Roche BenchMark XT全自動免疫組化機上進行。

1.4結果判定Cyclin D1陽性表達于腫瘤細胞核，而claudin7表達于細胞膜和(或)胞質，呈棕黃色細顆粒狀。按陽性細胞所占百分比并參考著色強度確定分級如下：無明顯陽性細胞為陰性(-)，陽性細胞數<25%為弱陽性(1+)，25%～50%為中度陽性(2+)，>50%為強陽性(3+)。

1.5統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，應用χ2檢驗及Fisher檢驗分析比較Cyclin D1和claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CyclinD1和claudin7在腫瘤旁腎組織中的表達20例腫瘤旁腎組織中，僅2例顯示Cyclin D1在腎小管及腎小球毛細血管散在陽性；而claudin7在腎遠端小管和集合管恒定細胞膜陽性，6例同時伴有近端小管胞質陽性。

2.2CyclinD1在不同類型腎腫瘤中的表達Cyclin D1在RO和ChRCC中的陽性率分別為86.2%(50/58)和8.2%(4/49)，前者均為中等以上陽性(22例2+，28例3+)；CCRCC(70.0%，98/140)、CCTPRCC(71.4%，10/14)和Xp11.2易位性腎細胞癌(42.9%，6/14)中均有不同程度表達；34例PRCC中僅有3例陽性，均表現為散在或灶狀陽性。統計學分析顯示，Cyclin D1在RO與ChRCC、RO與PRCC、CCRCC與ChRCC、PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌中的表達相比，組間差異均有統計學意義(P<0.05，表1，圖1)。

2.3claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達49例ChRCC中43例細胞膜陽性(87.8%)，其中35例中等以上陽性(17例2+，18例3+)；58例RO中12例陽性(20.7%，10例2+，2例3+)，但均定位于胞質；34例PRCC中17例陽性(50.0%，14例定位于胞膜，3例定位于胞質)，其中15例表現為中等以上陽性；14例CCTPRCC中8例(57.1%)陽性，均定位于細胞膜；而在CCRCC和Xp11.2易位性腎細胞癌中很少表達，陽性率分別為8.6%(12/140)和14.3%(2/14)。統計分析結果顯示，ChRCC與RO，CCRCC與ChRCC、CCTPRCC，PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌相比，各組間差異均具有統計學意義(P均<0.05，表2，圖2)。

表1 Cyclin D1在常見腎腫瘤中的表達

RO.腎嗜酸細胞瘤；ChRCC.嫌色細胞癌；CCRCC.透明細胞腎細胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2易位性腎細胞癌；CCTPRCC.透明細胞管狀乳頭狀腎癌; RO與ChRCC相比，χ2=64.72，P<0.000 1；RO與PRCC相比，χ2=52.56,P<0.000 1; CCRCC與ChRCC相比，χ2=55.87，P<0.000 1；PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌相比，χ2=4.28，P<0.05

表2 claudin7在常見腎腫瘤中的表達

RO.腎嗜酸細胞瘤；ChRCC.嫌色細胞癌；CCRCC.透明細胞腎細胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性腎細胞癌；CCTPRCC.透明細胞管狀乳頭狀腎癌；RO與ChRCC相比，χ2=47.82，P<0.000 1；CCRCC與ChRCC相比，χ2=11.30，P<0.000 1；CCRCC與CCTPRCC相比，χ2=26.57，P<0.000 1；PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌相比，χ2=45.29，P<0.05

2.4CyclinD1和claudin7聯合應用在不同類型腎腫瘤中的表達58例RO中40例(69.0%)表現為Cyclin D1陽性/claudin7陰性，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性僅2例(3.4%)；49例ChRCC中41例(83.7%)表現為Cyclin D1陰性/claudin7陽性，而Cyclin D1陽性/claudin7陰性僅2例(4.9%)，在RO和ChRCC的鑒別中，Cyclin D1陽性/claudin7陰性此種免疫表型對于RO的敏感性和特異性分別為69.0%和95.9%，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性對ChRCC診斷的敏感性和特異性分別為83.7%和96.6%；CCRCC主要表現為Cyclin D1陽性/claudin7陰性(92/140，65.7%)，其次為Cyclin D1陰性/claudin7陰性(36/140，25.7%)；14例CCTPRCC中有6例Cyclin D1陽性/claudin7陽性、4例Cyclin D1陽性/claudin7陰性，在CCRCC和CCTPRCC的鑒別中，Cyclin D1陽性/claudin7陰性此種免疫表型對于CCRCC的敏感性和特異性分別為65.7%和71.4%，而Cyclin D1陽性/claudin7陽性對CCTPRCC診斷的敏感性和特異性分別為42.9%和95%。PRCC中有17例表現為Cyclin D1陰性/claudin7陰性，其次14例為Cyclin D1陰性/claudin7陽性；14例Xp11.2易位性腎細胞癌中有8例Cyclin D1陰性/claudin7陰性、4例Cyclin D1陽性/claudin7陽性(表3)。

①A①B①C①D②A②B②C②D

圖1A.Cyclin D1在嗜酸細胞瘤中彌漫強陽性；B.Cyclin D1在嫌色細胞癌中陰性；C.Cyclin D1在透明細胞腎細胞癌中彌漫強陽性；D.Cyclin D1在透明乳頭狀腎細胞癌中彌漫強陽性，EnVision兩步法圖2A.claudin7在腎嗜酸細胞瘤中陰性；B.claudin7在腎嫌色細胞癌中彌漫強陽性膜表達；C.claudin7在乳頭狀腎癌中彌漫強陽性膜表達；D.claudin7在透明細胞乳頭狀腎癌中彌漫強陽性膜表達，EnVision兩步法

3 討論

腎腫瘤是一類異質性很高的腫瘤，不同腫瘤之間細胞形態可非常相似，如諸多腫瘤均可以表現為透明細胞或嗜酸細胞等，單純依靠形態學有時很難鑒別，免疫組化染色具有重要的輔助作用。有關Cyclin D1和claudin7聯合檢測在大宗腎腫瘤病例中的研究報道較少，現就兩者在常見腎腫瘤中的表達以及應用價值進行討論。

表3 Cyclin D1和claudin7聯合檢測在不同腎腫瘤中的表達

RO.腎嗜酸細胞瘤；ChRCC.嫌色細胞癌；CCRCC.透明細胞腎細胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性腎細胞癌；CCTPRCC.透明細胞管狀乳頭狀腎癌

Cyclin D1為細胞周期蛋白家族中的重要成員之一，在細胞周期G1/S轉換中發揮重要的正性調控作用，其含量隨細胞周期而呈周期性變化。正常組織中Cyclin D1表達量很少甚至不表達，而在乳腺癌[3]、非小細胞肺癌[4]、甲狀腺乳頭狀癌[5]等許多惡性腫瘤中存在蛋白過表達現象。Cyclin D1高表達可能與基因改變(包括染色體易位、基因擴增和基因組多態性)、轉錄后調控、翻譯后蛋白穩定等多種機制有關[6]。claudin7是claudins家族成員之一，claudin蛋白屬于緊密連接蛋白家族，是上皮細胞間緊密連接的主要結構之一，迄今已發現有24個亞型[7]。Cyclin D1在腫瘤旁腎組織中很少表達，本組20例中僅2例見腎小管上皮細胞及腎小球的毛細血管內皮細胞散在陽性。而claudin7主要在腎遠端腎小管和集合管中表達，不同節段的腎小管claudin7陽性表達定位不同(胞膜或胞質)，推測可能與腎小管的滲透功能狀態有關。

本組實驗發現，Cyclin D1和claudin7在RO和ChRCC中的表達差異有顯著性。Cyclin D1在86.2%的RO中陽性(50/58，均為中等以上陽性)，而ChRCC中僅有8.2%(4/49)陽性，差異有統計學意義(P<0.01)。相反，claudin7在RO中很少表達(20.7%，12/58)，且均表現為胞質陽性，而ChRCC中的陽性率為87.8%(43/49)，均為中到強的細胞膜著色，兩者之間相比差異有統計學意義(P<0.000 1)。統計分析顯示，Cyclin D1陽性/claudin7陰性對于RO的敏感性和特異性分別為69.0%和95.9%，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性對ChRCC的敏感性和特異性分別為83.7%和96.6%。Sukov等[8]應用免疫組化及FISH技術檢測63例RO和36例ChRCC中Cyclin D1蛋白的表達及CCND1基因重排，結果發現，所有ChRCC(0/36)均無Cyclin D1過表達及CCND1基因異常，然而33%(21/63)的RO存在Cyclin D1過表達，其中13例(62%)出現CCND1分離信號，42例無Cyclin D1過表達的病例中僅1例出現CCND1分離信號。關于Cyclin D1在RO中過表達的機制目前尚不清楚，一些個案報道和小宗病例研究發現部分RO出現染色體11q13上的CCND1基因易位，推測是導致Cyclin D1過表達的原因[9-10]。然而，部分RO免疫組化Cyclin D1過表達的病例，經FISH證實并無CCND1基因重排，表明Cyclin D1在RO中過表達除與CCND1基因易位或倒置外，可能還有其他機制。諸多文獻報道，claudin7在ChRCC中有較高的陽性率，如Lechpammer等[11]發現94%的ChRCC呈claudin7中等和強陽性，而RO僅55%陽性(P=0.041)；Osunkoya等[12]報道，7/11例ChRCC出現claudin7細胞膜表達和claudin8陰性的免疫組化模式，而17例RO僅1例出現此種表達模式(對ChRCC的敏感性為63%，特異性為84%，陽性預測值為88%)；claudin7陰性和claudin8細胞質陽性的免疫組化表達模式在10/17例RO中出現，而所有ChRCC(0/11)均無此種表達模式(對RO的敏感性為59%，特異性為100%，陽性預測值為100%)。國內楊敬等[13]報道claudin7在ChRCC和RO的陽性率分別為95.83%(23/24)和41.18%(7/17)。因此，Cyclin D1和claudin7聯合檢測以及后者的表達定位模式對于RO和ChRCC的鑒別具有重要意義。

Cyclin D1在其他不同組織類型的腎細胞癌中表達不一。Hedberg等[14]報道，53%(74/192)的CCRCC存在Cyclin D1高表達，其高表達與腫瘤具有較低的核分級、體積較小相關，并且陽性患者比陰性患者具有更長的生存期，但PRCC(10%，3/28)和ChRCC(21%，3/14)卻很少表達。Calderaro等[15]報道所有的腎髓質癌均呈Cyclin D1陽性(6/6)。Leroy等[16]報道Cyclin D1在所有的CCTPRCC中均呈陽性，42例中有35例表現為彌漫強陽性(83%，35/42)，7例表現為灶狀陽性。本組實驗結果顯示，Cyclin D1在70%的CCRCC(98/140)、57%的CCTPRCC(8/14)和43%的Xp11.2易位性腎細胞癌(6/14)中均有表達，但PRCC中卻很少表達(3/34，均為灶狀陽性)。統計結果顯示，CCRCC與ChRCC、Xp11.2易位性腎細胞癌(P均<0.01)，PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌(χ2=4.28，P=0.039)，組間相比差異均有統計學意義；但Cyclin D1在CCRCC與CCTPRCC的表達相比，差異無統計學意義。

Choi等[17]應用免疫組化技術檢測239例腎腫瘤中claudin7的表達，結果顯示其在ChRCC、RO、PRCC和CCRCC中的陽性率分別為95%、72.7%、34.5%和3.4%，其對ChRCC診斷的敏感性和特異性分別為95.0%和92.3%。Hornsby等[18]發現，claudin7在67%(24/36)的ChRCC胞膜陽性，與CCRCC(0，0/42)、PRCC(28%，8/29)和RO(26%，10/43)相比差異有統計學意義(P<0.001)，提出claudin7膜染色可作為嫌色細胞癌和其他腎腫瘤，包括形態學相似的嗜酸細胞瘤鑒別的候選免疫指標之一。本組實驗結果顯示，claudin7除在ChRCC中有較高的陽性率外，在PRCC(50%，17/34)和CCTPRCC(57%，8/14)中也常有表達，而CCRCC(12/140，8.6%)和Xp11.2易位性腎細胞癌(2/14，14.3%)中卻很少表達。統計分析顯示，claudin7在CCRCC與ChRCC、CCTPRCC(χ2=110.3、26.57，P均<0.000 1)，PRCC與Xp11.2易位性腎細胞癌(χ2=5.29，P<0.05)，各組間相比差異均有統計學意義。聯合檢測Cyclin D1和claudin7發現，RO主要表現Cyclin D1陽性/claudin7陰性，相反，ChRCC為Cyclin D1陰性/claudin7陽性；CCRCC、CCTPRCCC、Xp11.2易位性腎癌分別表現為Cyclin D1陽性/claudin7陰性、Cyclin D1陽性/claudin7陽性和Cyclin D1陰性/claudin7陰性。

綜上所述，Cyclin D1和claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達，差異有顯著性，聯合應用對于某些形態學容易混淆的腎腫瘤組織學分型具有重要作用。

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