胸腺瘤中E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達

黃 波，徐詠強，梁遠秋

胸腺瘤(thymoma)是一種呈惰性生長并且具有潛在惡性的胸腺上皮源性腫瘤，既有非常復雜的鏡下結構，又存在病理與預后之間的矛盾，其發生機制目前仍不清楚。

上皮細胞-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)機制和Wnt信號傳導通路是目前腫瘤研究的焦點。大量研究顯示在乳腺癌和結腸癌等多種腫瘤的侵襲過程中均伴有腫瘤細胞的EMT現象和Wnt信號傳導通路的改變。胸腺瘤是一種生物學行為非常復雜的腫瘤，目前研究認為30%～40%的胸腺瘤具有侵襲性。β-catenin基因定位于3q21.3，是Wnt信號通路中的重要調節因子，若其在細胞中出現異常積聚，則可導致腫瘤具有侵襲性[1-2]。E-cadherin是介導細胞間黏附的重要細胞因子，其低表達或者不表達被認為是EMT過程的標志，亦可促進腫瘤細胞的侵襲。E-cadherin與β-catenin結合形成E-cadherin-catenins復合體，其結構和功能的異常與許多腫瘤的侵襲密切相關。本組實驗聯合免疫組化和熒光原位雜交檢測，旨在探討E-cadherin和β-catenin蛋白及基因的表達與胸腺瘤侵襲性的相關性。

1 材料與方法

1.1材料選取2012年～2016年東莞市人民醫院存檔的胸腺瘤手術標本，即往診斷為A型、AB型、B1型、B2型、B3型及C型胸腺瘤的病例共120例。

1.2方法根據WHO(2015)胸腺腫瘤分類標準及Masaoka臨床分期方法、組織形態學特征、免疫組化標記、臨床特點和影像資料，對120例胸腺瘤按無侵襲性和有侵襲性分組，并對各組分別行E-cadherin和β-catenin蛋白免疫組化染色(SP法)及E-cadherin和β-catenin基因熒光原位雜交實驗。E-cadherin和β-catenin抗體免疫組化檢測設立PBS液代替一抗作陰性對照，以試劑盒內已知的陽性對照片作陽性對照。

1.3結果判定

1.3.1免疫組化染色結果半定量分析 E-cadherin蛋白主要定位于細胞膜，即細胞膜中出現棕黃色顆粒視為E-cadherin蛋白陽性。β-catenin蛋白則以細胞內出現棕黃色顆粒作為陽性標志，一般從胞膜、胞質和胞核三方面綜合判斷β-catenin蛋白在胞內的分布情況：胞膜>70%的細胞出現陽性則視為正常表達，反之<70%則視為膜表達缺失；胞質、胞核>10%的細胞陽性視為胞質、胞核陽性表達，胞質、胞核陽性表達常稱作異位表達，胞膜表達缺失及胞質、胞核表達均為異常表達。一般胞膜正常表達判為陰性，異常表達判為陽性。兩者均以陽性細胞百分比結合染色強度進行綜合計分。(1)染色強度評分標準：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。(2)陽性細胞數評分標準：陽性細胞數≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(2+)，9～12分為強陽性(3+)。

1.3.2FISH實驗結果判讀 E-cadherin基因結果判定：(1)閾值設定：隨機選取10例以上陰性對照樣本作為陰性質控片，每張陰性質控片隨機計數至少100個細胞，分別計算出各類型FISH陽性細胞的細胞數目及百分比，同時統計出百分比的標準差和平均值，陰性閾值則設為平均值+3倍的標準差。(2)計數方法：計數至少100個細胞，出現2R2G信號類型的細胞記為FISH陰性細胞；出現nR2G(n≤1)信號類型的細胞記為FISH陽性細胞。①若出現FISH陽性細胞的比例大于陰性閾值時，判斷為FISH陽性；②若出現FISH陽性細胞的比例小于陰性閾值時，判斷為FISH陰性；③如果FISH陽性的細胞比例與陰性閾值相等，則需加大計數的數目或者分析整張切片，如果仍然比陰性閾值小，則判為FISH陰性；否則視為FISH陽性。

β-catenin基因結果判定：β-catenin基因的探針采用綠色標記，正常細胞胞核中綠色的點為2個，當綠色點>2個時，說明該基因有擴增。高倍鏡下計數100個細胞核，其中標記基因信號數≥3的細胞核數目>40個，記為該病例擴增；11～40個之間記為臨界擴增；0～10個之間則記為無擴增。

1.4統計學處理采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。對組織中E-cadherin和β-catenin蛋白和基因的表達水平在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中行χ2檢驗，檢驗水準以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1鏡檢無侵襲性胸腺瘤大多為A、AB和B1型(圖1)。A型胸腺瘤幾乎無淋巴細胞，瘤細胞表現為卵圓形或梭形，且細胞核仁不明顯，腫瘤細胞呈實性片塊狀或車輻狀排列。AB型胸腺瘤組織學上呈彌散分布的結節狀，通常由淋巴細胞少的A型以及富含淋巴細胞的B型胸腺瘤混合而成。在A型成分區可見到所有A型胸腺瘤的特征，而B型成分區則是獨特的。B型成分區瘤細胞通常由小多角形上皮細胞組成，核小而圓。B1型胸腺瘤上皮細胞小且少，異型性通常不明顯，周圍可見非腫瘤性的T淋巴細胞環繞，可見胸腺小體。侵襲性胸腺瘤大多為B2、B3及C型(圖2)。B2胸腺瘤呈纖細分隔的粗大小葉，部分類似于正常胸腺皮質小葉結構，呈多角形，胞核大，染色質較稀疏，可見明顯的中位核仁。B3及C型胸腺瘤在組織學上腫瘤細胞呈小葉狀，通常由較厚的纖維及透明樣變的間隔分隔開，上皮內的淋巴細胞稀少，瘤細胞形成表皮樣結構或者呈模糊的實性片狀。

2.2E-cadherin和β-catenin蛋白在胸腺瘤中的表達E-cadherin蛋白在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽性率分別為87.69%(57/65)和58.18%(32/55)，差異有統計學意義(P<0.05)。β-catenin蛋白在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽性率分別為12.31%(8/65)和43.64%(24/55)，差異有統計學意義(P<0.05)(表1，圖3～6)。

表1 E-cadherin、β-catenin蛋白在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中的表達

2.3E-cadherin及β-catenin基因表達E-cadherin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中表達下調或缺失分別為15.38%(10/65)和56.36%(31/55)，統計分析顯示，E-cadherin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。β-catenin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達擴增率分別為26.15%(17/65)和58.18%(32/55)，統計分析顯示，β-catenin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達，差異有統計學意義(P<0.05)(表2，圖7、8)。

表2 E-cadherin、β-catenin基因在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中的表達

3 討論

本組120例胸腺瘤，按照WHO(2015)胸腺腫瘤新分類標準，綜合胸腺瘤鏡下特點、免疫標記、Masaoka臨床分期標準、臨床表現、影像資料以及相關文獻將其分類，其中侵襲性胸腺瘤55例，無侵襲性胸腺瘤65例。胸腺瘤患者的預后水平與腫瘤是否發生侵襲關系密切，大量研究表明，有侵襲性的胸腺瘤患者預后水平明顯比無侵襲性的胸腺瘤患者差，無侵襲性的胸腺瘤患者5年和10年生存率分別為75%和63%，而有侵襲性胸腺瘤患者的5年和10年生存率分別為50%和30%[3-5]。本實驗聯合免疫組化及熒光原位雜交技術分別檢測E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達，以期為有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的診斷和鑒別診斷提供有效的生物學指標。本組實驗結果表明，E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達與胸腺瘤的侵襲性有顯著相關性。

①②③④⑤⑥⑦⑧

圖1無侵襲性胸腺瘤(AB型)：腫物由淋巴細胞較少的A型成分及富于淋巴細胞的B型成分構成，A型成分細胞呈梭形，B型成分細胞呈小多角形，核較小，圓形或卵圓形，核仁不明顯圖2有侵襲性胸腺瘤(B3型)：由呈巢片狀生長的上皮樣細胞和淋巴樣細胞混合增生構成，上皮樣細胞核呈空泡狀，核仁明顯圖3無侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽性，SP法圖4有侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽性，SP法圖5無侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽性，SP法圖6有侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽性，SP法圖7有侵襲性胸腺瘤組織中E-cadherin基因陽性，FISH圖8有侵襲性胸腺瘤組織β-catenin基因擴增，FISH

近年隨著分子遺傳學研究在胸腺瘤分類和鑒別診斷方面的不斷應用，使得分子生物學在胸腺瘤的診斷及鑒別診斷方面的地位日益突顯[6]。相關研究證實，E-cadherin基因低表達或不表達及β-catenin基因高拷貝數擴增表達可促進多種腫瘤的侵襲。E-cadherin和β-catenin兩種蛋白在胸腺瘤中的表達已有相關報道，然而這兩種基因在胸腺瘤中的表達情況則尚未見相關報道。

E-cadherin作為一種鈣依賴性細胞跨膜糖蛋白，近年來隨著研究的不斷深入，E-cadherin已成為探討瘤細胞侵襲性的熱點。E-cadherin是一種抑癌基因，位于人類16號染色體長臂16q22.1，其編碼的氨基酸有723～748個[7]。E-cadherin幾乎在所有上皮組織中呈不同程度的表達，在細胞之間的連接中起關鍵性作用，其能夠影響腫瘤細胞與正常細胞之間的黏附，因此其表達水平下降將導致腫瘤的侵襲，從而影響患者預后[8-9]。如今，E-cadherin抑制癌細胞侵襲這一觀點已經得到廣泛認可[10-11]。E-cadherin表達異?？赏ㄟ^多種機制來促使腫瘤發生侵襲[12-13]：(1)E-cadherin表達異常將降低瘤細胞之間的黏附能力，使得腫瘤細胞脫離瘤體而發生侵襲；(2)E-cadherin表達異?？梢源龠M人體基質金屬蛋白酶的分泌和基質降解，加快細胞的侵襲；(3)脫離瘤體的細胞無接觸抑制作用，將不再與相鄰細胞競爭生長因子，因此得到的生長刺激信號將會更多；(4)瘤細胞與瘤體分離后發生侵襲能夠得到更多營養。

胸腺瘤的發生、發展是多因素參與的復雜過程。近年來，隨著分子遺傳學及分子生物學等學科的飛速發展以及檢測方法的日新月異，發現很多與胸腺瘤發病相關的基因，這對于我們更進一步認識胸腺瘤的發病機制、界定胸腺瘤的組織分型和分級、對患者進行生物治療以及判斷患者預后提供新方向。本組實驗發現，E-cadherin基因在腫瘤細胞中的表達強度比在正常細胞中低，并且E-cadherin基因的表達強度與腫瘤的侵襲性密切相關。實驗過程中采用熒光原位雜交技術檢測E-cadherin基因時采取了紅綠雙探針，以此來做內對照，即紅色探針是本組的目的基因，綠色探針是對照基因，且綠色對照基因位于紅色目的基因的隔壁。當綠色信號正常而紅色信號減少時，認為基因表達下調或缺失，當然要排除假陰性；而當綠色信號不足2個時，則該細胞不納入計數范圍。這些發現提示：E-cadherin參與的EMT機制在胸腺瘤的侵襲過程中有著非常重要的作用。綜合分析，作者認為E-cadherin參與胸腺瘤的侵襲進程，其在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷中有一定的輔助意義。

β-catenin是由原癌基因編碼的一種細胞骨架蛋白，位于染色體3q21.3，全長23.2 KB，含16個外顯子，其相對分子質量為9.3×104。β-catenin是一種多功能蛋白質，參與細胞間的黏附和WNT信號的傳導。β-catenin可以與E-cadherin的胞內區相互作用并參與E-cadherin黏附功能的調節，因此β-catenin發生故障會使E-cadherin參與細胞黏附失去穩定性。此外，其還可以與E-cadherin胞內區組成E-cadherin/cat復合體，這也是其發揮生物學效應的前提條件。Wnt信號通路包括包膜卷曲蛋白、Wnt蛋白、E-cadherin、β-catenin、GSK-3p、Axin、APC、TCf以及松散蛋白等，β-catenin在此通路中有著重要的地位，其不但參與信號的轉導，還參與細胞間的黏附。此外，β-catenin還可激活EMT過程中的某些相關基因，如Fibronectin和Slug等，加速瘤細胞的EMT進程。多項研究結果顯示，在結腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤的侵襲過程中均可見到β-catenin在細胞質和細胞核中的異常蓄積[14-15]。

本實驗采用免疫組化法檢測β-catenin蛋白和熒光原位雜交技術檢測β-catenin基因表達，發現β-catenin蛋白和基因在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中表達差異有統計學意義。結合本實驗結果，作者認為β-catenin對有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷有一定的輔助意義。

綜上所述，本組實驗結果顯示，免疫組化法檢測E-cadherin和β-catenin蛋白及熒光原位雜交技術檢測E-cadherin和β-catenin基因，有助于無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷。

[1] Detterbeck F, Youssef S, Ruffini E,etal. A review of prognostic factors in thymic malignancies[J]. J Thorac Oncol, 2011,6(7):1698-1704.

[2] Song Z, Jin X, Zhang Y. Treatment and prognosis of type B2 thymoma[J]. World J Surg Oncol, 2014,12(1):291-295.

[3] 張 杰, 朱 蕾. “國際胸腺惡性腫瘤興趣組織關于WHO胸腺瘤和胸腺癌組織學分類應用共識”的解讀[J]. 中華病理學雜志, 2015,61(3):153-157.

[4] 孫也淇, 陳 崗. 使用WHO病理分型診斷胸腺上皮性腫瘤的誤診分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2014,30(3):292-294.

[5] Liang C C, Lu T L, Yu Y R,etal. β-catenin activation drives thymoma initiation and progression in mice[J]. Oncotarget, 2015,6(16):13978-13993.

[6] 蘇家俊, 陳 玉, 徐方平, 等. 胸腺瘤臨床病理學與分子病理學研究進展[J]. 中華病理學雜志, 2015,61(9):683-685.

[7] Roden A C, Yi E S, Jenkins S M,etal. Diagnostic significance of cell kinetic parameters in World Health Organization type A and B3 thymomas and thymic carcinoma[J]. Hum Pathol, 2015,46(1):17-25.

[8] 孟凡青, 聶 嶺. 解讀2014年ITMIG胸腺上皮性腫瘤分類共識[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(2):121-123.

[9] Kim S A, Inamura K, Yamauchi M,etal. Loss of CDH1(E-cadherin)expression is associated with infiltrative tumour growth and lymph node metastasis[J]. Br J Cancer, 2016,114(2):199-206.

[10] Liu Y, Zhang L, Meng Y,etal. Benzyl isothiocyanate inhibits breast cancer cell tumorigenesis via repression of the FoxH1-Mediated Wnt/β-catenin pathway[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,15,8(10):17601-17611.

[11] Wang R, Sun Q, Wang P,etal. Notch and Wnt/β-catenin signaling pathway play important roles in activating liver cancer stem cells[J]. Oncotarget, 2016,7(5):5754-5768.

[12] Shan S, Lv Q, Zhao Y,etal. Wnt/β-catenin pathway is required for epithelial to mesenchymal transition in CXCL12 over expressed breast cancer cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(10):12357-12367.

[13] 哈力木拉提·木爾扎提, 賽力克·馬高維亞, 華天書, 等. CDH1和MLH1蛋白在甲狀腺癌中的表達及臨床意義[J]. 中國癌癥雜志, 2012,22(5):329-335.

[14] Cha Y J, Han J, Kim J,etal. A rare case of mixed type a thymoma and micronodular thymoma with lymphoid stroma[J]. J Pathol Transl Med, 2015,49(1):75-77.

[15] 沈 展, 吳 濤. 胸腺瘤最新WHO病理分型與重癥肌無力及臨床分期之間的關系[J]. 臨床和實驗醫學雜志, 2015,31(2):106-108.