甲狀腺乳頭狀癌中DOG-1和C-erbB-2的表達及臨床意義

賀亞敏，高麗麗，李 惠，錢曉萍

甲狀腺癌占發展中國家所有惡性腫瘤的1%，是內分泌系統中最常見的惡性腫瘤[1]。近年來我國甲狀腺癌的發病率呈逐年增高趨勢。甲狀腺癌中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為多見[2]。絕大多數PTC惡性程度低，生長緩慢，病死率低，預后較好，但也有部分逐漸出現失分化現象，出現生長迅速、遠處轉移，同時病灶也表現出不攝碘而對放射性碘治療療效差的情況。現已發現不少基因變異與分化型甲狀腺癌的發生、發展、轉歸有關。已經發現的甲狀腺癌相關基因達數十種[3]，但目前尚未發現針對甲狀腺癌完全特異性的基因標志物。因此，有待更多的研究篩選出高特異性的相關基因，以及多個基因的聯合檢測，為甲狀腺癌的診斷、靶向治療以及預后風險分層提供依據。C-erbB-2是一種原癌基因，在美國國立綜合癌癥網絡指南中已明確其擴增與乳腺癌和胃癌的預后和靶向治療顯著相關，但在甲狀腺癌中研究較少。DOG-1(又名ANO1, TMEM16A)，是胃腸間質瘤(gastrointestinal stromal tumors, GIST)相對特異性的診斷標志物之一，近來還被發現其是一種鈣激活的氯離子通道[4-6]，除具有重要的生理功能，在乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌等惡性上皮性腫瘤中的研究發現其與腫瘤的增殖和侵襲轉移相關[7]。DOG-1在甲狀腺癌中的表達目前尚未有報道。本實驗應用免疫組化法對48例PTC和30例甲狀腺良性病例中DOG-1和C-erbB-2表達進行檢測，以初步探討DOG-1及C-erbB-2在PTC中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2013年1月～2016年6月南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院手術切除且病理確診的48例PTC(其中經典型42例，濾泡亞型6例)和30例甲狀腺良性病變(結節性甲狀腺腫15例、橋本甲狀腺炎15例)。

1.2試劑與方法鼠抗人C-erbB-2、DOG-1即用型單克隆抗體、二抗SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚切片，免疫組化SP法檢測步驟嚴格按照說明書進行，采用微波抗原修復，用已知的乳腺癌及GIST陽性切片分別作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3結果判定C-erbB-2或DOG-1染色陽性物質定位于細胞質和(或)細胞膜，呈棕黃色顆粒。具體標準為：整個切片未見陽性著色為陰性(-)；陽性細胞數<10%為弱陽性(+)；10%～50%為陽性()；>50%為強陽性()。

1.4統計學分析采用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行統計學分析，統計方法采用χ2檢驗，Spearman相關性檢測，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1DOG-1和C-erbB-2在甲狀腺良、惡性病變中的表達DOG-1在良性病變組織中無表達(0/30，0)，而在PTC中的表達增高(27.08%，13/48)(圖1)。C-erbB-2在結節性甲狀腺腫中不表達(0/15)，在橋本甲狀腺炎中有1例弱陽性(1/15)，在PTC中表達增高(39.58%，19/48)(圖2)，兩者差異均有統計學意義(P<0.05)。DOG-1及C-erbB-2在PTC中的表達主要定位于胞質，部分混合胞膜(表1)。

表1 DOG-1和C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變組織中的表達

2.2DOG-1和C-erbB-2表達與PTC臨床病理特征的關系在48例甲狀腺乳頭狀癌中有淋巴結轉移者27例，無淋巴結轉移者21例，有淋巴結轉移組中DOG-1和C-erbB-2陽性例數分別為12例(8例強陽性，2例陽性，2例弱陽性)和17例(9例強陽性，5例陽性，3例弱陽性)，占44.44%和62.96%(P<0.05)；無淋巴結轉移組中DOG-1和C-erbB-2陽性例數分別為1例和2例，均為弱陽性或陽性，占4.76%和9.52%，兩組相比差異均有顯著性(P<0.05，表2)。本組實驗結果亦顯示，DOG-1或C-erbB-2高表達與腫瘤分期、腺外侵犯亦相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小以及病灶是否多發無關(P>0.05)。

2.3在淋巴結轉移且有多灶的甲狀腺乳頭癌中DOG-1和C-erbB-2表達的相關性盡管DOG-1和C-erbB-2表達在病灶的單發和多發組之間差異無顯著性，但在20例有淋巴結轉移且有多發癌灶的PTC中，DOG-1與C-erbB-2常協同高表達(40%，8/20，8例均呈強陽性)，并呈顯著正相關(r=0.503，P=0.024，表3)。

①A①B②A②B

圖1A.DOG-1在甲狀腺乳頭狀癌中呈強陽性，在周圍正常濾泡上皮(下方)中陰性；B.DOG-1在乳頭狀癌中的表達以胞質為主，SP法

圖2A.C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌中呈強陽性，在周圍正常濾泡上皮(左側)中陰性；B.C-erbB-2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達以胞質為主，SP法

表2 DOG-1和C-erbB-2表達與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的關系

*P<0.05

表3 C-erbB-2和DOG-1在多灶且有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌中的表達

3 討論

DOG1也被命名為TMEM16A(transmem-brane protein 16A)和ANO1(anoctamin 1)，是TMEM16家族成員之一。DOG1是一種鈣激活的氯離子通道蛋白，其編碼基因位于人染色體11q13區，包含26個外顯子，編碼960個氨基酸。DOG1蛋白約114 Kb，是一個具有8個跨膜功能區的膜蛋白。人11號染色體長臂1區3帶集中了很多惡性上皮性腫瘤(乳腺癌、膀胱癌等)發生、發展相關的重要基因如CCND1等，因此DOG-1與癌發生、發展的關系也成為研究熱點。DOG-1在GIST中表達穩定，在90%以上GIST中出現DOG-1的表達，其敏感性與特異性均與CD117相似甚至略高，約1/3 CD117陰性的GIST中可檢到DOG-1的表達，因而DOG-1最早被作為GIST診斷及鑒別診斷的重要抗體。鈣激活的氯離子通道蛋白參與眾多的生理過程，如上皮細胞電解質和水的分泌、感覺轉導、神經和心肌細胞興奮性調節、血管緊張度的調節等，最新研究結果表明其還與細胞生長、增殖以及侵襲有關[8]。DOG-1作為鈣激活的氯離子通道蛋白，其作用顯然不應僅局限于作為GIST的標志物。Ayoub等[9]的研究結果證實頭頸部鱗狀細胞癌細胞系中DOG-1的高表達有助于細胞的容積改變，促進侵襲，從而引起轉移進展，與差預后相關。此外在肝癌、前列腺癌中也發現DOG-1有高表達，沉默、抑制或者敲除ANO1基因，會抑制腫瘤細胞的增殖，并促進細胞的凋亡[10-11]。那么DOG-1是如何促進腫瘤增殖及侵襲轉移的呢？目前研究結果揭示可能是通過激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CAMKⅡ)信號隨后激活PI3K-AKT通路促進食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌的進展[12]。也有研究表明[13]是通過激活RAS-RAF-MEK-ERK1/2通路導致了腫瘤細胞的增殖。

正是基于研究中揭示的DOG-1和EGFR之間的關系，作者選擇了與EGFR(ErbB1)一樣同屬HER/ErbB家族，結構和功能高度相似的C-erbB-2(HER2/ErbB2)。正常情況下，C-erbB-2癌基因參與調控細胞的生長、增殖和分化。如果C-erbB-2是激活的，結構的變化將導致過度表達，C-erbB-2蛋白在各種腫瘤中的表達水平各研究結果均有差別。

本實驗顯示，DOG-1和C-erbB-2在PTC中表達會增高，陽性率分別為27.08%(13/48)和39.58%(19/48)。而在良性病變組織中不表達或僅有個別表達，但其表達率顯示作為甲狀腺良惡性病變鑒別診斷的價值有限。本組實驗亦顯示，PTC有淋巴結轉移者DOG-1以及C-erbB-2的陽性率明顯高于無淋巴結轉移者，兩者差異有顯著性。文獻報道，結直腸癌中C-erbB-2的陽性率為25.64%，其表達與結直腸癌浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關[14]。本組PTC中C-erbB-2和DOG-1的表達與淋巴結轉移、TNM分期、腺外侵犯密切相關，與文獻相符。尤其在多灶且有淋巴結轉移的PTC中C-erbB-2和DOG-1呈協同高表達，從而提示DOG-1和C-erbB-2通過某種機制互相影響，聯合檢測可以作為PTC患者預后指標之一。

除了為PTC的預后分層提供依據外，一些研究[15]還顯示DOG-1的過表達還可以提高頭頸部鱗狀細胞癌對EGFR靶向治療藥吉非替尼的敏感性，針對DOG-1和EGFR的聯合靶向治療將降低單藥耐藥可能性。聯合抑制DOG-1的過表達還增加針對EGFR過表達的西妥昔單抗以及C-erbB-2高表達的曲妥珠單抗的敏感性，減少耐藥[16]。眾所周知，對碘131難治性PTC以及復發病例的治療是臨床面臨的巨大挑戰，隨著對甲狀腺癌分子機制研究的不斷深入，越來越多的靶向藥物開展了針對甲狀腺癌的臨床試驗。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)是目前在甲狀腺癌中研究最多的靶向治療藥物[17]。包括索拉非尼、舒尼替尼、凡得替尼、阿昔替尼、莫替沙尼和吉非替尼等在內的多個TKIs已開展了臨床試驗，證實TKIs在一定程度上可以緩解疾病進展。但是，至今尚無患者出現完全治愈，部分緩解率最高也不足50%。因此，本組實驗的結果為難治性PTC多靶點的聯合治療提供新依據。推測DOG-1為可能的靶向治療標志物。

在其它腫瘤中DOG-1及C-erbB-2蛋白的表達主要在胞膜，而本組實驗中，這兩者在PTC中的表達主要在上皮的胞質中，這說明DOG-1及C-erbB-2蛋白在不同組織中的表達模式不同，可能與代謝、再循環和降解過程有關。DOG-1在PTC中的作用分子機制需要進一步研究。本組實驗中涉及的病例并未包含高細胞型、柱狀細胞型等高危亞型，以后有待進一步深入探討。

[1] Wei S F, Gao M, Qian B Y,etal. Analysis of variation trends of thyroid cancer treated in Tianjin Cancer Hospital form 1954 to 2009[J]. Chin J Oncol, 2011,33(8):613-615.

[2] 李曉靜, 蔣 玲, 婁萍萍. 甲狀腺癌臨床及病理學特點的回顧性分析[J]. 中華內分泌代謝雜志, 2013,29(12):1010-1017.

[3] 周 元, 蔣紅鋼, 李 克. 甲狀腺癌分子標志物研究進展[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(5):565-568.

[4] Yang Y D, Cho H, Koo J Y,etal. TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance[J]. Nature, 2008,455(7217):1210-1215.

[5] Schroeder B C, Cheng T, Jan Y N,etal. Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit[J]. Cell, 2008,134(6):1019-1029.

[6] Caputo A, Caci E, Ferrera L,etal. TMEM16A, a membrane protein associated with calcium dependent chloride channel activity[J]. Science, 2008,322(5901):590-594.

[7] 梅麗麗, 史志周. 鈣離子激活的氯離子通道蛋白ANO1在腫瘤發病機制中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016,32(4):759-761, 768.

[8] Stanich J E, Gibbons S J, Eisenman S T,etal. Ano1 as a regulator of proliferation[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011,301:G1044-G1051.

[9] Ayoub C, Wasylyk C, Li Y,etal. ANO1 amplification and expression in HNSCC with a high propensity for future distant metastasis and its functions in HNSCC cell lines[J]. Br J Cancer, 2010,103(5):715-726.

[10] Deng L, Yang J, Chen H,etal. Knockdown of TMEM16A suppressed MAPK and inhibited cell proliferation and migration in hepatocellular carcinoma[J]. Onco Targets Ther, 2016,14(9):325-333.

[11] Liu W, Lu M, Liu B,etal. Inhibition of Ca(2+)-activated Cl(-) channel ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma[J]. Cancer Lett, 2012,326(1):41-51.

[12] Britschgi A, Bill A, Brinkhaus H,etal. Calcium-activated chloride channel ANO1 promotes breast cancer progression by activating EGFR and CAMK signaling[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(11):E1026-E1034.

[13] Duvvuri U, Shiwarski D J, Xiao D,etal. TMEM16A induces MAPK and contributes directly to tumorigenesis and cancer progression[J]. Cancer Res, 2012,72(13):3270-3281.

[14] 楊 悅, 萬義增, 陳素賢, 等. 結直腸癌組織中EGFR及HER-2的表達及臨床意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(6):615-618.

[15] Bill A, Gutierrez A, Kulkarni S,etal. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy inhead and neck cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(11):9173-9188.

[16] Kulkarni S, Bill A, Godse N R,etal. TMEM16A/ANO1 suppression improves response to antibody-mediated targeted therapy of EGFR and HER2/ERBB2[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2017,56(6):460-471.

[17] Ye L, Santarpia L, Gagel R F. The evolving field of tyrosine kinase inhibitors in the treatment of endocrine tumors[J]. Endocr Rev, 2010,31(4):578-599.