LKB1基因對前列腺癌細胞增殖的影響

劉 治，潘大慶，徐從云，陶 陶，吳 奎，肖 峻

目前，前列腺癌已經成為男性最常見的泌尿系惡性腫瘤之一，我國前列腺癌患者的人數也有逐年增加的趨勢，防治前列腺癌的發生和提高前列腺癌患者生存率已迫在眉睫。因此，對于前列腺腫瘤細胞分子機制的探討也是目前臨床研究的重點方向。LKB1/STK11(liver kinase B1/serine-threonine kinase 11)基因編碼433個氨基酸，其中包括N端結構域、C端結構域和激酶結構域。LKB1廣泛表達于人多個器官以及組織中，如胰腺、腎、肺、結腸等，且參與調控多種生物學過程，如細胞能量代謝、細胞周期、細胞增殖及細胞極性。目前，大多數研究表明LKB1作為抑癌基因在多種惡性腫瘤中呈低表達，如非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等。在常染色體顯性遺傳黑斑息肉綜合征(peutzJeghers syndrome, PJS)患者中也發現存在LKB1基因突變的現象，而且PJS綜合征患者的癌癥如消化道惡性腫瘤的概率也明顯增加[1-4]。本實驗以高表達LKB1蛋白的前列腺癌細胞系(PC-3)為研究對象，針對LKB1基因過表達后探討PC-3的生物學行為改變，為進一步探討列腺癌的發病機制提供思路。

1 材料與方法

1.1一般資料PC-3、pLV-EGFP(2A)Puro載體由上海拜科生物公司提供；Flag抗體、β-actin均購于Abcam 公司；細胞總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Cell Kit)、反轉錄試劑盒購自天根生物公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自于Thermo Scientific公司，ECL發光試劑盒由上海天能科技公司提供，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1質粒構建 根據人LKB1全長基因序列設計出一對PCR引物，上游引物包含EcoR I酶切位點，下游引物含Xho Ⅰ酶切位點并且攜帶Flag標簽。上游引物序列：5′-CCGGAATTCATGGAGGTGGTGGACCCGCA-3′，下游引物序列5′-CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGC TTGCAGGCCGACAGC-3′，引物均由上海生物公司合成。根據以上設計合成的引物應用KOD酶擴增LKB1序列，反應條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min延伸。反應所得PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠回收試劑盒回收并純化PCR產物，-20 ℃保存。

用EcoR I和Xho I限制性內切酶對載體pLV-EGFP(2A)Puro以及PCR膠回收產物進行雙酶切，然后將酶切回收得到的目的基因片段和載體進行連接反應，反應后的反應體系轉化DH5α感受態菌株，并涂板于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，于次日挑克隆進行菌落PCR驗證，并將陽性克隆送檢進行測序比對(測序在上海生物工程公司完成)。

1.2.2重組慢病毒的包裝 待細胞密度達70%～80%時，將重組慢病毒載體質粒pLV-EGFP(2A)Puro-LKB1-Flag和包裝質粒，按照Lipofectamine 2000使用說明書共轉染包裝細胞293T細胞。轉染后20 h更換為完全培養基，24 h之后，鏡下可觀測到細胞融合現象(提示病毒包裝成功并開始產生病毒顆粒)。轉染48、72 h后分別收集細胞上清液，1 500 r/min×10 min離心，0.45 μm濾過膜過濾，分裝至離心管，12 000 r/min×30 min、4 ℃離心濃縮病毒，于-80 ℃保存備用。存放于液氮中更佳。

1.2.3重組慢病毒感染以及穩定株篩選 將PC-3細胞稀釋成1×105/mL細胞懸液，再以1×104/孔的密度接種于6孔板，然后加入重組慢病毒濾液，感染24 h后棄去含病毒的培養基，更換新鮮的完全培養基。繼續培養24 h后，加入終濃度2 μg /mL嘌呤霉素，每隔2天左右更換1次含嘌呤霉素(終濃度2 μg/mL)的培養基。2周后收集細胞，采用qPCR/Western blot法檢測LKB1的蛋白表達水平。

1.2.4Western blot法檢測LKB1蛋白的表達水平 棄去空白對照組(Blank組)、陰性對照組(NC組)以及LKB1過表達組(LKB1組)PC-3細胞中的培養液，預冷PBS清洗細胞1遍，收取各組細胞，使用RIPA細胞裂解液裂解3組PC-3細胞，然后提取細胞總蛋白；按BCA蛋白濃度測定法檢測3組PC-3細胞總蛋白濃度；平衡各組上樣濃度，然后使用SDS-PAGE凝膠電泳，隨后5%牛奶封閉1 h，分別用Flag、β-actin一抗4 ℃孵育過夜(Flag、β-actin抗體稀釋比分別為1 ∶1 000，1 ∶200，HRP標記的二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，最后ECL發光顯色。

1.2.5qPCR檢測LKB1 mRNA的表達 提取Blank組、NC組、LKB1組PC-3細胞的總RNA，隨后分別以3組PC-3細胞總RNA為模板反轉錄合成cDNA，然后分別用LKB1，內參的引物進行PCR擴增，qPCR法檢測細胞中LKB1 mRNA的表達，LKB1引物序列：正向5′-TGGTTCCGGAAGAAACATCCC-3′，反向5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TCAACGACCCCTTCATTGAC-3′，反向5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。

1.2.6CCK-8法檢測PC-3細胞的增殖能力 取密度長到約90%的未處理的Blank組PC-3細胞，以及NC組和LKB1組的PC-3穩轉細胞系接種于96孔板，實驗孔每孔為3×103/mL細胞，96孔板邊緣預留空白孔并加入等量滅菌PBS溶液，同時3組分別設置3個復孔。分別在鋪細胞后0、24、48、72 h時每孔中加入一定量的CCK-8溶液，繼續培養2 h，利用酶標儀測定各實驗孔吸收光值，并根據所得數據繪制各組細胞的生長曲線圖。

1.3統計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計數資料采用t檢驗、計量資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Westernblot法檢測LKB1蛋白的表達利用Western blot法檢測Blank組、NC組、LKB1組PC-3細胞中LKB1蛋白的表達，結果顯示LKB1組PC-3細胞過表達LKB1(圖1)。

2.2qPCR法檢測LKB1的表達利用qPCR法檢測Blank組、NC組、LKB1組PC-3細胞中LKB1 mRNA的表達，相對于Blank組、NC組，LKB1組PC-3細胞中LKB1 mRNA的表達顯著升高(圖2)。

圖1 PC-3細胞中LKB1蛋白的表達

圖2 PC-3細胞中LKB1 mRNA的表達

2.3CCK-8法檢測PC-3細胞的增殖能力CCK-8法檢測Blank組、NC組、LKB1組PC-3細胞0、24、48、72 h各時間點細胞的活力，結果顯示LKB1組PC-3細胞的生長活力于鋪細胞24 h后開始，明顯低于Blank組及NC組PC-3細胞；但Blank組以及NC組PC-3細胞生長活力差異無顯著性(表1)。3組細胞的生長曲線圖顯示，LKB1組PC-3細胞與Blank組PC-3細胞相比，生長速度受到明顯抑制，而Blank組和NC組PC-3細胞相比生長速度差異無顯著性(圖3)。

圖3 LKB1對PC-3細胞增殖的影響

分組0h24h48h72hBlank組0.1321±0.0250.2407±0.0290.4351±0.0340.7775±0.047NC組0.1297±0.0160.2398±0.0310.4317±0.0240.7801±0.029LKB1組0.0835±0.0290.1568±0.0280.2340±0.0410.3750±0.026

3 討論

前列腺癌是多因素、多步驟、多基因共同作用的結果，涉及腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、遷移等一系列生物學過程。目前，大多數研究認為LKB1可以通過激活AMPK和抑制mTOR進而調節腫瘤細胞的增殖，在能量不足的情況下，AMPK通路上游基因LKB1能夠磷酸化AMPK，從而激活AMPK，負性調控下游mTOR活性，并進一步影響腫瘤的進展。大量研究表明，LKB1在多種腫瘤，如子宮頸腫瘤卵巢癌、腎透明細胞癌中低表達甚至缺失，而且這些腫瘤的發生、發展也與LKB1基因密切相關[5-8]。研究發現，在肺腺癌、鱗癌以及大細胞癌等不同亞型的肺癌中，發現均存在LKB1基因的突變[9-11]。相關研究表明，在LKB1基因敲除后的腫瘤細胞中，相比于正常未經處理的腫瘤細胞，AMPK的表達降低，而且LKB1基因敲除后的腫瘤細胞的增殖活性及侵襲能力會明顯增強。這些實驗結果均提示我們LKB1是重要的抑癌基因，抑制LKB1會增強腫瘤細胞的增殖、分化及侵襲。

現有研究中，病毒已經成為常見的DNA或RNA有效載體。利用病毒為載體可以大大提高DNA或RNA進入細胞的效率，因此在基因傳遞載體中最為高效[12]。慢病毒載體具有以下特征：(1)能夠將目的基因整合至宿主基因組中，穩定表達；(2)具有感染分裂和非分裂細胞的能力；(3)具有廣泛性[13]。本實驗成功構建了LKB1過表達慢病毒質粒，分別轉染LKB1過表達質粒及陰性對照空載質粒于前列腺癌PC-3細胞，再經過嘌呤霉素篩選得到NC組穩轉細胞系、LKB1過表達組穩轉細胞系。并且利用CCK-8法檢測了LKB1對不同組細胞增殖狀態的影響。qPCR和Western blot檢測結果表明，與Blank組、NC組比較，LKB1組的LKB1 mRNA水平和蛋白表達水平均明顯升高；CCK-8實驗結果表明，與Blank組和NC組相比，LKB1組PC-3細胞的增殖能力明顯受到抑制，表明LKB1基因表達增強后，會明顯抑制PC-3細胞的增殖能力。提示我們LKB1基因在前列腺癌發生、發展中發揮重要作用，LKB1可作為研究前列腺癌細胞增殖分子機制的新靶點。

細胞持續旺盛的增殖是腫瘤細胞重要的特征之一，如何調控腫瘤細胞的增殖是目前腫瘤治療的重點研究內容之一。由于現在對LKB1在腫瘤發生、發展進程中所發揮的功能尚未完全清楚，LKB1所涉及的信號通路和其在相關信號通路中所參與的機制也沒有完全清楚。本實驗初步探討了過表達LKB1后對前列腺癌細胞增殖能力的影響，為進一步觀察LKB1的分子機制和深入探討LKB1在腫瘤發生、發展中的作用提供了一定的理論基礎，也為后續研究前列腺癌細胞的增殖調控機制提供潛在的重要靶點。

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