朱砂腎臟毒性的分解研究

史 立，孫 友，李 佳，李丹陽(yáng)，趙躍剛

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 長(zhǎng)春 130117）

朱砂腎臟毒性的分解研究

史 立，孫 友，李 佳，李丹陽(yáng)，趙躍剛*

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 長(zhǎng)春 130117）

目的 研究朱砂中與血液中汞離子濃度以及腎臟毒性相關(guān)的成分，為朱砂的減毒炮制以及在臨床上的科學(xué)用藥提供重要的理論依據(jù)。方法 應(yīng)用偏微分原理，運(yùn)用化學(xué)、毒理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)以及細(xì)胞學(xué)的研究方法，對(duì)朱砂中與其毒性相關(guān)的成分進(jìn)行均一背景下的分解研究，從中找出與朱砂腎臟毒性相關(guān)的主要成分。結(jié)果 整體實(shí)驗(yàn)研究表明，朱砂中共存成分改變了汞在血液以及體液中的化學(xué)位，從而改變離子通道的通透性，有利于汞離子通過(guò)離子通道而被吸收以及在腎臟中分布；朱砂中的腎臟毒性成分并非僅來(lái)源于硫化汞或汞本身，其他共存成分對(duì)朱砂毒性的影響也是不可忽視。結(jié)論 改進(jìn)朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制過(guò)程中，盡量除去硝酸根、氯離子、鎂離子等不必要的共存離子，減小水飛朱砂的毒性，可提高臨床用藥的安全性和制劑的安全性。

朱砂；腎臟毒性；汞離子；炮制方法

Abstract:?Objective To study some components relative to the concentration of mercury in plasma and the toxicity associated with cinnabar, and provide important evidence for the safety and reasonable application of cinnabar in clinical medicine and scientific preparation.Methods On the basis of partial differential principle, doing research on the components concerned to cinnabar toxicity respectively and equally by the methods of chemistry,toxicology, pharmacokinetics and cytology for finding components corresponding to cinnabar toxicity.Results The overall experimental results show that some coexisting ingredients of cinnabar may cause the changes of the chemical potential of mercury in plasma, as well as body fluid, and the permeability of the ion channel, which is conducive to gastrointestinal absorption and transportation to kidney of mercury ions.Experiments on cells indicate that almost all its components of cinnabar contribute to its toxicity.Conclusion In order to reduce the toxicity of water-handled cinnabar and make it safer, both in clinical treatment and industrial products, cinnabar processing methods should be improved by removing nitrate, chloride, magnesium ions unnecessary coexisting ions .

Keywords:?cinnabar; nephrotoxicity; mercury ion; processing method

朱砂以其確切的療效而使其藥用價(jià)值位居礦物藥之首，然而其被人們逐漸認(rèn)知的毒性備受科學(xué)界乃至全社會(huì)的關(guān)注[1]。朱砂中含有幾十種元素，而且基本都以無(wú)機(jī)形式存在，每種元素在體內(nèi)的吸收、分布與排泄過(guò)程都涉及微孔途徑的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[2]，每種成分都和朱砂的毒性有一定的關(guān)系[3-9]。為了探究朱砂腎臟毒性的機(jī)理，筆者首先對(duì)朱砂的毒性進(jìn)行了分解研究，并將血液和腎臟同時(shí)作為研究對(duì)象，采用藥物動(dòng)力學(xué)以及病理學(xué)方法，對(duì)朱砂的腎臟中毒機(jī)理進(jìn)行了初步的分解研究。

1 材料與方法

1.1 材料 AFS-930 原子熒光分光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司），SANYO二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），SANYO 超低溫冰柜（日本SANYO公司），Themo生物安全柜，BIO-RAD酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司），Mettler Toledo AL204電子分析天平（萬(wàn)分之一），TD 40臺(tái)式低速離心機(jī)（4 000 r/min）（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司），YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器，可調(diào)微量移液器 （上海亞榮生化儀器廠），水飛朱砂（河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM干粉培養(yǎng)基（GIBCO）、胰蛋白酶（北京鼎國(guó)昌盛有限責(zé)任公司）等。

1.2 方法

1.2.1 給藥供試品的制備 將1.0 g水飛朱砂置于冰水浴中，使之在40 kHz頻率超聲波作用下溶出，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，用原子熒光分光光度法分析游離金屬汞的總含量。依據(jù)研究結(jié)果和汞在胃腸道的吸收機(jī)理以及在體內(nèi)的表觀分布容積，確定朱砂及其他藥物動(dòng)力學(xué)研究灌胃給藥供試品的制備方法。朱砂、HgS平行定量實(shí)驗(yàn)組、HgCl2平行定量實(shí)驗(yàn)組供試品的游離汞含量均為8.561 μg/mL；HgCl2高劑量實(shí)驗(yàn)組供試品的游離汞含量均為171.22 μg/mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪 選擇優(yōu)級(jí)純的HgCl2為標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液為溶劑，配制HgCl2儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）,備用。分別定量移取儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL至10 mL的容量瓶中，各定量加入家兔血漿500 μL，并用作為溶劑的0.1%的K2Cr2O7的 10%的 HNO3溶液定容至刻度，得25、50、100、150、200、250 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與原子熒光光度計(jì)上測(cè)定其吸光度，線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3.502 X-0.921(r2=0.998 8)。

1.2.3 血漿供試品制備 按照預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)從實(shí)驗(yàn)家兔耳緣靜脈采血1.0 mL，置入肝素化試管中，精密加入50 μL35%的HClO4,渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min離心10 min。精密量取上清液300 μL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，測(cè)定其吸光度。

1.3.4 組織供試品制備 對(duì)稱取實(shí)驗(yàn)家兔耳腎臟區(qū)2.0 g，制成組織勻漿，于4 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL，精密加入50 μL 35%的HClO4,渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min離心10 min。精密量取上清液300 μL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果

2.1 單劑量給藥動(dòng)力學(xué)研究 分組：將30只家兔隨機(jī)分為5組，第1組為陰性對(duì)照組，第2組為朱砂實(shí)驗(yàn)組，第3組為HgS實(shí)驗(yàn)組，第4組和第5組為平行量的HgCl2實(shí)驗(yàn)組和高劑量的HgCl2實(shí)驗(yàn)組。給藥：第2組灌胃給2 mL供試品；第3組灌胃給HgS平行定量供試品溶液2 mL；第4組灌胃給HgCl2平行定量供試品溶液2 mL，第5組灌胃給20倍標(biāo)示量的HgCl2供試品2 mL。于給藥后的0.5、1.0、1.5、2.0 h取全血進(jìn)行分析。結(jié)果在灌胃給藥后的0.5～2.0 h，除平行量HgCl2實(shí)驗(yàn)組外，朱砂實(shí)驗(yàn)組、HgS實(shí)驗(yàn)組、高劑量HgCl2實(shí)驗(yàn)組的Hg2+在血液中的濃度均高于陰性對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加而增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)。而平行量HgCl2實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 多劑量給藥動(dòng)力學(xué)研究 分組：將30只家兔隨機(jī)分為5組，第1組為陰性對(duì)照組，第2組為朱砂實(shí)驗(yàn)組，第3組為HgS實(shí)驗(yàn)組，第4組和第5組為平行量的HgCl2實(shí)驗(yàn)組和高劑量的HgCl2實(shí)驗(yàn)組。給藥：第2組灌胃給2 mL供試品；第3組灌胃給HgS平行定量供試品溶液2 mL；第4組灌胃給HgCl2平行定量供試品溶液2 mL，第5組灌胃給20倍標(biāo)示量的HgCl2供試品2 mL。均灌胃給藥1次/d，并于給藥后1.0 h取全血進(jìn)行分析。結(jié)果在灌胃給藥后的10、20、40 d，朱砂實(shí)驗(yàn)組、HgS實(shí)驗(yàn)組、平行量HgCl2實(shí)驗(yàn)組、高劑量HgCl2實(shí)驗(yàn)組的Hg2+在血液中的濃度均高于陰性對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加而增大，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)。

2.3 MTT細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)研究 本次實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5組，第1組為空白對(duì)照組：以正常增值細(xì)胞為空白對(duì)照組；第2組為朱砂實(shí)驗(yàn)組：以朱砂靜止飽和溶液為供試品(Hg2+濃度為3.2 μg/mL )；第3組為靜止飽和溶液實(shí)驗(yàn)組：HgS靜止飽和溶液為供試品（Hg2+濃度為5.3 μg/mL ）；第4組為高劑量氯化汞實(shí)驗(yàn)組（Hg2+濃度為10.0 μg/mL ），第5組為中劑量氯化汞實(shí)驗(yàn)組（Hg2+濃度為5.0 μg/mL ），第6組為中劑量氯化汞實(shí)驗(yàn)組（Hg2+濃度為2.0 μg/mL ）。取同批次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK 293細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。置于5% CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,每種藥物設(shè)有4個(gè)復(fù)孔，用以保證藥物反應(yīng)的真實(shí)情況，置于5% CO2，37 ℃孵育24 h。取出，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，并于每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

結(jié)果表明，朱砂實(shí)驗(yàn)組、HgS實(shí)驗(yàn)組、氯化汞實(shí)驗(yàn)組（高、中、低3個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組）吸光度值均低于陰性對(duì)照組，且隨著Hg離子濃度的增大其吸光度減小，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，朱砂中可以讓細(xì)胞凋亡的并非是目前公認(rèn)的硫化汞或汞離子，朱砂在體內(nèi)的蓄積，并以此導(dǎo)致的腎臟中毒問(wèn)題，亦并非是硫化汞或汞離子，其中共存成分的影響是不可忽視的。本研究結(jié)果為朱砂在臨床上的安全用藥提供了重要的依據(jù)。建議改進(jìn)朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制過(guò)程中，盡量除去硝酸根、氯離子、鎂離子等不必要的共存離子，以提高臨床用藥的安全性和制劑的安全性。

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Study on the renal toxicity of some components in cinnabar by respective researches

SHI Li, SUN You, LI Jia, LI Danyang, ZHAO Yuegang*
(School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R285.6

A

2095-6258(2017)05-0712-02

2017-03-01）

OI：10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.008

吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目“朱砂中與其腎臟蓄積相關(guān)成分的量效關(guān)系研究”（2014-Q27）。

史 立（1959 -），男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物分析及藥物化學(xué)研究。

*通信作者：趙躍剛，電話-13604414377，電子信箱-1006110724@qq.com