紅豆杉中紫杉烷類成分含量測定方法研究進展

馮學花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

紅豆杉中紫杉烷類成分含量測定方法研究進展

馮學花，曹殿潔，謝偉，孟迪

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

紫杉醇是紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)中一種優良的天然抗癌成分，但因其在紅豆杉中的含量極少而不能得到廣泛推廣應用。紫杉烷類化合物作為合成紫杉醇的前體，近年來備受關注。對紫杉烷類化合物含量測定方法的研究進展進行了綜述。

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)；紫杉烷類；含量測定方法；研究進展

紅豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)是遠古第四紀冰川遺留下來的古老植物，有著250萬年的悠久歷史，為國家一級重點保護植物，自然分布極少。紅豆杉樹全身是寶，其莖、葉、枝、果實、心木、皮均可入藥，因此又被稱為“黃金樹”[1～3]。紅豆杉主要含有紫杉烷類、黃酮類、倍半萜等多種化學成分，其中紫杉烷類包括紫杉醇及2種重要前體巴卡亭Ⅲ(BⅢ)和10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)，紫杉醇是近40a來發現的存在于紅豆杉中的一種有效天然抗癌活性成分，臨床上已被成功應用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療。由于紫杉醇在紅豆杉中的含量甚微，因此作為紫杉醇的合成前體紫杉烷類化合物具有廣闊的研究前景[4]。為此，筆者對紫杉烷類化合物含量測定方法研究進展進行了綜述，以為紫杉烷類化合物的進一步開發和利用提供參考。

1 紅豆杉中紫杉醇含量的測定

1.1高效液相色譜法

何法霖等[5]建立了一種高效液相色譜法測定加拿大紅豆杉浸膏中紫杉醇含量的方法，實驗條件選擇PFP柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長227nm，室溫條件，進樣5μL，圖譜采集時間45min。方法中考察了檢測波長、流動相組成和提取方法3個因素，選擇了多種不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水和乙腈-水等流動相體系，結果以甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)等效洗脫的分離效果最佳。通過在190～550nm波長范圍內進行掃描，發現紫杉醇在227nm處有最大吸收，因此確定227nm作為檢測波長。蔡玉梅等[6]采用HPLC法測定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量，實驗系統條件設置為AngilentHypersilODS2柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動相，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為227nm，進樣量10μL。實驗結果表明紫杉醇和三尖杉寧堿結構比較相近，較難分離，對比發現以HypersilODS2柱效果為好，含量測定方法準確可行，重復性好，可以測定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量。

高效液相色譜法(HPLC)測定紫杉醇及其他紫杉烷類化合物的含量，具有高效能、高速速的分離檢測特點，其分析過程中的關鍵環節是流動相組成和比例、洗脫方式等，這種方法因具有靈敏度高、適用范圍廣、分析速度快且不破壞樣品等優勢在含量分離分析方面得到廣泛應用。

1.2固相萃取-反相高效液相色譜法

李儉等[7]采用HPLC內標法測定了南方紅豆杉不同部位中紫杉醇的含量。實驗系統條件設置為：甲醇-乙腈-水(22∶36∶42)為流動相，流量為1.0mL/min，230nm為檢測波長，進樣10μL，圖譜采集時間為10min。實驗采取一次性固相萃取柱純化，配合使用標準溶液過C18小柱,進樣量1mL，分別用10mL水、2mL50%甲醇溶液連續洗脫5次，繼續用1.5mL的80%甲醇溶液連續洗脫5次，分別收集各次洗脫液進行色譜分析。結果表明，固相萃取相對于液-液萃取法、硅膠柱層析法或硅膠薄板層析法等方法效果較好，能在不洗脫紫杉醇的前提下最大限度地洗脫雜質而后將紫杉醇完全洗脫。

2 紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)含量的測定

紫杉烷類化合物為合成紫杉醇或其類似物的前體，能合成比自身抗癌活性更高的物質。紫杉烷萜類化合物主要存在于紅豆杉樹枝、葉等部位中，其含量可達紫杉醇的數十倍之多，其中，10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)就是一種常見的紫杉烷類化合物，可用于合成比紫杉醇等具有更高抗癌活性的紫杉醇類似物[7]。因此，對紅豆杉資源中紫杉烷類物質含量測定方法進行研究具有重要意義。

2.1高效液相色譜法

胡杰等[8]采用HPLC法測定了東北紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：以C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)為色譜柱，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)為流動相，檢測波長選擇234nm，檢測溫度32℃，流速為0.8mL/min，進樣量為10μL。實驗中設計了多種流動相體系，通過對比不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫的流動體系條件下的檢測結果，確定了甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)作為流動相，因其分離效果和重現性相對較高。該實驗結果表明用該法測定10-DABⅢ的含量結果準確，可以用于監控質量或為新藥的研究開發提供依據。安春志等[9]應用HPLC內標法測定了云南紅豆杉枝葉提取物中10-DABⅢ的含量。色譜條件選擇C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)為流動相，檢測波長227nm。實驗通過對多種流動相體系如不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脫及梯度洗脫進行對比發現大多液相條件在4min出峰，而甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)在13min左右出峰。另外，為降低成本和減少毒性，采用乙醇代替甲醇，效果良好。通過實驗發現，高效液相色譜法可靠簡便、重現性好、靈敏度高、專屬性強，具有較高實用價值，對建立紅豆杉提取物中紫杉烷萜類10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ的指紋圖譜和質量控制較為實用。

2.2固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法

孔繁晟[10]采用固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法測定云南紅豆杉枝葉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。實驗及色譜條件為：固相萃取柱為Agilent ODS C18500mg/3mL，色譜柱為Agilentzorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水-乙腈( 35∶55∶10)，流速設置為1.0mL/min，檢測波長227nm，柱溫30℃。固相柱的洗脫溶液分別是0.01mol/L的乙酸銨、40%的甲醇乙酸銨溶液、80%的甲醇乙酸銨溶液40mL淋洗，最后用甲醇溶液淋洗固相柱。實驗發現在1.6～8.0μg/mL范圍內，10-DABⅢ的線性關系良好，此法可用于紅豆杉枝葉中10-DABⅢ的含量測定。根據實驗結果發現用固相柱對樣品進行處理后再進行含量測定，既可以去除雜質又能有效保護色譜柱，方法穩定，結果準確可靠。

2.3反相高效液相色譜法(RP-HPLC)

甄鏵[11]采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定了歐洲紅豆杉中10-DABⅢ的含量。色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫(0→27min，乙腈的體積分數為20%→50%)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測波長232nm；進樣量20μL。理論塔板數按10-DABⅢ峰計算不低于10000。實驗中10-DABⅢ在乙腈-水中易溶，進行HPLC分析時，10-DABⅢ保留時間隨乙腈的比例升高而縮短，因此實驗通過調整乙腈的比例來改變10-DABⅢ的分離度。實驗在制樣方法和用硅膠柱層析中有針對性地對10-DABⅢ粗分離進行了研究，該方法具有過程簡單、續制樣、效率高、重現性好、成本低、低檢出等優點，簡化HPLC分析的前處理，能得到滿意的效果。甄樺等[12]采用反相高效液相色譜法測定曼地亞紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量，色譜條件為：色譜柱為Shim-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-水(45∶55)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進樣量20μL；檢測波長232nm；靈敏度0.16AUFS。在該色譜條件下，10-DABⅢ對照品保留時間為10min，理論塔板數12918。10-DABⅢ的色譜峰與鄰近峰的分離度大于1.5，分離度良好。實驗過程簡單，所需條件容易實現，所以是測定10-DABⅢ含量的方法之一。

2.4超高液相色譜法(UPLC)

張靜等[13]采用UPLC法同時測定曼地亞紅豆杉中10-DABⅢ、三尖杉寧堿和紫杉醇的含量，并對不同采收期、不同部位曼地亞紅豆杉中這3種有效成分的含量變化規律進行了研究分析。色譜條件為：色譜柱為AC-QUITY UPLC BEH Shield RP 18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8min，78%A；8～11min，78%A→65%A；11～44min，65%A)；流速0.2mL/min，檢測波長227nm，柱溫25℃；進樣量1μL。該色譜條件下，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，分離度良好，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數均大于30000，能夠滿足分析需求。實驗結果表明，該法可以用來測定紫杉烷類含量。

3 結語

SPE-HPLC法、RP-HPLC法、UPLC法等是近年來紫杉烷類化合物含量測定的常用方法，這些方法各有特點。不難發現，紫杉烷類化合物的測定方法以高效液相色譜法為多，高效液相色譜法具有高效能、高速度、高靈敏度、重現性好等優點。所用流動相中多含有乙腈和水，分離效果較好，采用乙腈系統流動相時，柱壓較低，洗脫能力較強，保留時間適中，峰形對稱性好。由于紫杉醇藥材的昂貴性以及特殊的生物活性，在醫藥領域越來越多地受到重視，而發展快速、簡便、靈敏、準確的活性物質含量測定方法則是研究開發和應用紫杉醇的基礎。

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[2]張文玲，鄭寰宇.紫杉醇與卡鉑聯合復方紅豆杉膠囊治療晚期卵巢上皮癌105例臨床觀察[J].山西醫藥雜志(下半月刊)，2011，(5):490～491.

[3]唐俐.紫杉醇周療治療復發性或難治性卵巢上皮癌的臨床觀察[J].中國現代醫藥雜志，2011，(1):88～89.

[4]徐廣俠,劉格戈.紫杉醇治療晚期胃癌臨床療效觀察[J].中國衛生產業，2014，(34):114～115.

[5]何法霖,盧建偉,趙銳，等.HPLC測定加拿大紅豆杉浸膏中紫杉醇的含量[J].中國中藥雜志，2007，32(8):753～754.

[6]蔡玉梅，李清蘭，林茂帆，等.HPLC法測定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量[J].安徽農業科學，2010，(28):15600～15601.

[7]李儉，劉宇，時美慧，等.HPLC內標法測定南方紅豆杉不同部位中紫杉醇的含量[J].軍事醫學，2011，(8):624～626.

[8]胡杰，蔣劍平，熊耀康，等.HPLC、UPLC測定南方紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].中國中醫藥科技，2016，(2):168～169，171.

[9]安春志，羅佳波，劉莉，等.HPLC法測定云南紅豆杉枝葉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].廣州醫藥，2006，37(5):47～49.

[10]孔繁晟.云南紅豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色譜法測定[J].時珍國醫國藥，2010，21(6):1426～1427.

[11]甄鏵.RP-HPLC法測定歐洲紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].中國藥房，2009，20(27):2125～2126.

[12]甄鏵,蒲尚饒,張學毅.反相高效液相色譜法測定曼地亞紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究[J].藥物分析雜志，2008，28(3):358～361.

[13]張靜，廖海兵，金永春，等.UPLC法同時測定曼地亞紅豆杉中3個有效成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31(11):2073～2077.

2017-05-16

安徽省教育廳自然科學重點項目(KJ2015A313)；安徽省大學生創新訓練項目(201612216094)；安徽新華學院校級自然科學重點項目(2016zr008)。

馮學花(1979-)，女，碩士，副教授，主要從事藥物分析研究，fxh77@126.com。

[引著格式]馮學花，曹殿潔，謝偉，等.紅豆杉中紫杉烷類成分含量測定方法研究進展J.長江大學學報(自科版) ，2017，14(18)：51～53.

Q949.66;R927.2

A

1673-1409(2017)18-0051-03

[編輯] 余文斌