類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血巨噬細(xì)胞極化特征分析

孫曉萱 王艷艷 張繆佳 王 嬙

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見的慢性炎癥性疾病[1]。巨噬細(xì)胞作為重要的效應(yīng)靶細(xì)胞，是促炎癥因子的主要來源之一，可作為炎癥因子和調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生者與RA的發(fā)病密切相關(guān)[2-3]。

巨噬細(xì)胞是一類具有異質(zhì)性、可塑性的免疫細(xì)胞[4]。為了有效的適應(yīng)微環(huán)境，巨噬細(xì)胞可通過改變自身表型而形成具有不同形態(tài)功能的亞群：經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（Classically activated macrophages，CAM，等同于 M1型巨噬細(xì)胞）和替代性活化巨噬細(xì)胞（Alternative activated macrophages，AAM，相當(dāng)于M2型巨噬細(xì)胞）。其中M1型巨噬細(xì)胞具有促炎癥反應(yīng)特性，可分泌促炎因子如白細(xì)胞介素（Interleukelin，IL）-6、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；M2型巨噬細(xì)胞其特點為產(chǎn)生抗炎癥細(xì)胞因子，如IL-10，有促進血管生成及組織修復(fù)的作用[5-6]。

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）分別是促進單核細(xì)胞向M1及M2型巨噬細(xì)胞分化的調(diào)控因子[7]。巨噬細(xì)胞極化與RA發(fā)病密切相關(guān)，GM-CSF敲除后，膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型鼠（Collageninduced arthritis，CIA）發(fā)病率及關(guān)節(jié)炎評分顯著降低[8]。M1型與M2型巨噬細(xì)胞是在功能上相互拮抗的細(xì)胞亞群，二者在特定的細(xì)胞因子微環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)化。巨噬細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用已得到充分證實，而M1/M2失衡是否在RA病程中扮演重要角色尚不清楚。本研究重點探討RA患者外周血中M1及M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，初步探討巨噬細(xì)胞極化在RA中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

27例RA患者來自江蘇省人民醫(yī)院風(fēng)濕科門診2015年3月—2016年5月的就診患者，均符合2009年ACR/EULAR制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除糖尿病、高血壓、感染等疾病。其中，女性23例，男性4例，平均年齡為47歲，病程為1個月～30年。21例年齡和性別匹配的健康對照均來自江蘇省人民醫(yī)院體檢中心健康體檢者。研究遵循的程序符合本院醫(yī)學(xué)倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得該委員會的批準(zhǔn)。標(biāo)本的采集均獲得受試者知情同意后完成。

1.2 試劑與儀器

PE-CD68、PE-CD163、APC-CX3CR1及其同型對照抗體均購自美國eBioscience公司；Alexa-Flour 647-CCR2及其同型對照抗體購自美國BD公司；紅細(xì)胞裂解液，購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；PCR引物，由美國Invitrogen公司合成；Trizol購自美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

（1）流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血M1及M2型巨噬細(xì)胞所占比例 收集RA患者及對照組外周血200 μl，分別標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞（CD68、CCR2）及M2型巨噬細(xì)胞（CX3CR1、CD163）及其同型對照抗體；加入以1∶10稀釋的紅細(xì)胞裂解液；流式細(xì)胞儀檢測M1及M2型巨噬細(xì)胞所占比例。

（2）其他常用RA實驗室項目檢測 酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定抗環(huán)瓜氨酸（Cyclic citrullinated antibody，CCP）抗體，散射比濁法測定C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和類風(fēng)濕因子（RF），魏氏法測定血沉（Erythrocyte sedimentation rate，ESR）等，由本院風(fēng)濕免疫科實驗室和臨床檢驗中心完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5分析數(shù)據(jù)并作圖，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗，M1及M2巨噬細(xì)胞比例與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 RA患者外周血M2型巨噬細(xì)胞比例顯著低于健康對照者

以單核細(xì)胞設(shè)門，分析外周血M1及M2型巨噬細(xì)胞的比例（圖1A）。發(fā)現(xiàn)RA患者外周血M1型巨噬細(xì)胞比例（2.107%±0.2813%）較健康對照組（1.461%±0.2162%）有所升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖1B）。健康對照組M2型巨噬細(xì)胞的比例高達(dá)（3.959%±0.350%），而RA患者外周血中M2型巨噬細(xì)胞的比例僅為（1.712%±0.217%），具顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001，圖1C）。進一步分析M1/ M2比值的變化，結(jié)果顯示RA患者外周血PBMC中M1/ M2比值顯著增高（P＜0.01，圖1D）。

圖1

2.2 RA患者外周血M2型巨噬細(xì)胞比例與臨床及實驗室指標(biāo)相關(guān)性分析

在此基礎(chǔ)上，進一步分析了RA患者外周血中M2型巨噬細(xì)胞與抗CCP抗體、RF、晨僵時間、關(guān)節(jié)腫脹及壓痛數(shù)、疾病活動性評分（Disease Activity Score-28，DAS28）、血沉、C-反應(yīng)蛋白等與RA疾病活動相關(guān)的臨床與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RA外周血中M2型巨噬細(xì)胞比例與ESR、CRP及晨僵時間均呈負(fù)相關(guān)：分別為：ESR：r=-0.3998，P=0.0388；CRP：r=-0.3810，P=0.0499；晨僵時間：r=-0.3889，P=0.0450（圖2A-C）；與其他實驗室檢查結(jié)果無顯著相關(guān)性（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖2

3 討論與結(jié)論

有研究提示，敲除M1型巨噬細(xì)胞分化調(diào)控因子GMCSF后，CIA小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生率降低，關(guān)節(jié)炎癥狀減輕，表示巨噬細(xì)胞極化可能參與RA發(fā)病過程。此外，RA患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α和干擾素-γ（Interferon-γ）水平顯著增高，IL-10水平顯著降低，表明RA患者體內(nèi)炎性微環(huán)境，可能會影響巨噬細(xì)胞極化。本研究中我們經(jīng)過一系列分析，發(fā)現(xiàn)RA患者外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中 M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD68及CCR2增高，而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD163及CX3CR1顯著降低，說明巨噬細(xì)胞，尤其是M2型巨噬細(xì)胞在RA發(fā)病機制中起重要作用。

綜合上述，巨噬細(xì)胞極化有可能通過介導(dǎo)炎癥和組織損傷，影響Th1和Th2細(xì)胞功能，參與RA病理過程。為進一步揭示外周血PBMC中巨噬細(xì)胞極化與RA病情的關(guān)系，本研究又將巨噬細(xì)胞極化水平與代表RA病情活動的幾項指標(biāo)進行了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血M2型巨噬細(xì)胞比例與晨僵時間、血沉及C-反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)，可見外周血巨噬細(xì)胞極化水平可作為RA患者病情活動的一個較敏感的指標(biāo)。由于巨噬細(xì)胞極化在免疫和慢性炎癥中有十分重要的作用，因此研究其水平變化對全面闡明RA發(fā)病機理，獲得新的、從不同層面和角度協(xié)助判斷RA發(fā)病與臨床活動程度的實驗室診斷有促進作用。

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