甘露消毒丹及其拆方對(duì)感染腸道病毒71型細(xì)胞miR—146a和Toll樣受體4 mRNA表達(dá)的影響

艾碧琛 何宜榮 曹蓉 何棟 趙國(guó)榮 賀又舜

摘要：目的 探討甘露消毒丹及其拆方對(duì)腸道病毒71型（EV71）感染后免疫及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。方法 運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)甘露消毒丹組（甘全方組）、清殘方組、利殘方組、病毒唑組、正常組、模型組，進(jìn)行病毒毒力和藥物細(xì)胞毒性測(cè)定后，以藥物作用于EV71感染后的RD細(xì)胞，24 h后RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-146a、Toll樣受體4（TLR4）mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組miR-146a mRNA表達(dá)降低，TLR4 mRNA表達(dá)升高；與模型組比較，甘全方組、清殘方組、利殘方組miR-146a mRNA表達(dá)升高、TLR4 mRNA表達(dá)降低，病毒唑組與模型組比較差異不明顯；與甘全方組比較，清殘方組miR-146a、TLR4 mRNA表達(dá)降低，利殘方組miR-146a mRNA表達(dá)升高、TLR4 mRNA表達(dá)降低；與清殘方組比較，利殘方組miR-146a mRNA表達(dá)升高，TLR4 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)論 甘露消毒丹可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a、TLR4 mRNA表達(dá)從而影響EV71感染所致免疫反應(yīng)，其中清殘方與利殘方可能存在互相拮抗效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：甘露消毒丹；拆方；腸道病毒71型；miRNA-146a；Toll樣受體4

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.015

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）03-0061-05

Effects of Ganlu Xiaodu Dan and Its Incomplete Prescription on Expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in Cells Infected by EV71 AI Bi-chen1， HE Yi-rong1， CAO Rong1， HE Dong2， ZHAO Guo-rong1， HE You-shun1 （1. TCM School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Ganlu Xiaodu Dan and its incomplete prescription on expressions of MiR-146a and TLR4 mRNA in RD cells infected by EV71. Methods With technique of cell culturing， Ganlu Xiaodu Dan therapy group， incomplete Qing prescription therapy group， incomplete Li prescription therapy group， normal cells control group， model control group and ribavirin control group were set， and tests for virus toxicity and medicine toxicity in cells were taken， then expressions of miRNA-146a and TLR4 mRNA in these RD cells 24 hours after intervention with medicine were detected. Results Compared with normal cells control group， miR-146a in mRNA model control group decreased and TLR4 mRNA increased. Compared with model control group， miR-146a mRNA in Ganlu Xiaodu Dan therapy group， incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group all increased while TLR4 mRNA decreased， and differences between ribavirin control group and model control group were not significant. Compared with Ganlu Xiaodu Dan therapy group， both expressions of miR-146a and TLR4 mRNA in incomplete Qing prescription therapy group were lower； miR-146a increased and TLR4 mRNA decreased in incomplete Li prescription therapy group. Compared with incomplete Qing prescription therapy group， miR-146a mRNA in incomplete Li prescription therapy group increased， but expression of TLR4mRNA between them was not significant. Conclusion Ganlu Xiaodu Dan can regulate the immune reactions caused by infection of EV71 by increasing expression of miR-146a mRNA and reducing expression of TLR4 mRNA. There may be antagonism effect between incomplete Qing prescription and incomplete Li prescription.

Key words： Ganlu Xiaodu Dan； incomplete prescription； EV71； miRNA-146a； TLR4

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81173188）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2016年）

通訊作者：賀又舜，E-mail：youshunh@sina.com

手足口病是由多種腸道病毒引起的一種嬰幼兒和兒童常見(jiàn)傳染病，近年手足口病的發(fā)病率及病死率有增高趨勢(shì)[1]。腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A組16型（CoxAl6）為手足口病最主要的致病病毒，其中重癥手足口病病情進(jìn)展快，死亡率較高，多由EV71感染引起，致死原因主要為腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫。目前缺乏特異高效的抗手足口病病毒藥物，對(duì)手足口病尚無(wú)特異性治療方法，主要以對(duì)癥治療為主，療效并不理想。中醫(yī)學(xué)者大多認(rèn)為手足口病屬中醫(yī)學(xué)“濕溫”“時(shí)疫”“春溫”等范疇，提出用衛(wèi)氣營(yíng)血辨證或三焦辨證進(jìn)行辨治，其中濕熱困阻中焦或毒在氣分時(shí)，甘露消毒丹為臨床常用選方之一[2-3]。但甘露消毒丹治療手足口病的作用機(jī)制尚不十分明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，甘露消毒丹能影響EV71復(fù)制的多個(gè)環(huán)節(jié)而發(fā)揮直接抗病毒作用[4-5]。本研究以在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及抗病毒中發(fā)揮重要作用的miR-146a和Toll樣受體4（TLR4）mRNA為切入點(diǎn)，探討甘露消毒丹對(duì)EV71感染免疫與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用；同時(shí)，進(jìn)行拆方研究，希望有助于闡釋方中有效組分或功能團(tuán)的配伍機(jī)理，全面闡釋其多靶點(diǎn)治療作用，或可助于科學(xué)簡(jiǎn)化處方行為要素。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞），美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)液（含10%牛血清）培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次。細(xì)胞維持液為含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、2%新生牛血清的DMEM，消化液為0.25%胰蛋白酶溶液。

1.2 病毒

EV71病毒，武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所提供。EV71接種于單層RD細(xì)胞上，加維持液后置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待出現(xiàn)75%以上的病變時(shí)收獲，凍融3次后吹打離心，4000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥物及制備

甘露消毒丹（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“甘全方”，劑量參照《方劑學(xué)》[6]記載）：滑石15 g，茵陳11 g，黃芩10 g，石菖蒲6 g，木通5 g，川貝母5 g，藿香4 g，豆蔻4 g，連翹4 g，射干4 g，薄荷4 g。甘露消毒丹清熱解毒殘方（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“清殘方”）：黃芩10 g，薄荷4 g，連翹4 g，川貝母5 g，射干4 g。甘露消毒丹化濁利濕殘方（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“利殘方”）：滑石15 g，茵陳11 g，木通5 g，豆蔻4 g，石菖蒲6 g，藿香4 g。上述飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，湖南中醫(yī)藥大學(xué)潘清平教授鑒定均為正品。中藥常規(guī)煎煮法煎煮2次，合并藥液，制備成含原藥材0.25 g/mL的藥液，濾紙過(guò)濾后再以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。病毒唑注射液，規(guī)格100 mg/mL，江蘇蘇星制藥有限公司，批號(hào)0110409，以蒸餾水配制成3 mg/mL溶液。

1.4 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30243.01B；胎牛血清，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SV30087.02；胰蛋白酶消化液，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)11476232；二甲基亞砜（DMSO），上海生工生物工程公司，批號(hào)2924B239；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），上海生工生物工程公司，批號(hào)TB0799；DnaseI，上海生工生物技術(shù)有限公司；SYBR?PremixExTaq?，寶生物工程（大連）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，加拿大Fermentas公司；RT-PCR試劑盒，上海生工生物技術(shù)有限公司；Trizol，Invitrogen公司；引物由寶生物工程（大連）有限公司代為設(shè)計(jì)、合成。生物安全柜（Haier公司），超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司），Centrifuge5415R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus公司），7900HT熒光定量PCR儀（ABI公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（賽百奧科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病毒毒力測(cè)定

計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量TCID50（Reed-Muench法），采用100TCID50進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)[4-5]。

2.2 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定

MTT法計(jì)算其細(xì)胞存活率（以不同濃度藥物的OD值計(jì)算），以細(xì)胞存活率（%）為縱坐標(biāo)、藥物濃度為橫坐標(biāo)（g/mL）繪制非線性回歸曲線。以90%細(xì)胞存活率濃度為各藥的實(shí)驗(yàn)濃度[4-5]。

2.3 藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)

取RD細(xì)胞接種于無(wú)菌6孔細(xì)胞板，100 μL/孔，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后吸棄培養(yǎng)液，每孔接種病毒液50 μL，輕混，待吸附1.5 h后吸棄病毒液，將90%細(xì)胞存活率的甘全方、清殘方、利殘方、病毒唑藥液50 μL與50 μL維持液混合，分別加到RD細(xì)胞上，各設(shè)4復(fù)孔。另每孔均設(shè)模型組、正常組，正常組孔內(nèi)加維持液100 μL，模型組孔內(nèi)接種病毒液50 μL，吸附1.5 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μL。24 h后收集細(xì)胞，加入Trizol，待RT-PCR檢測(cè)miRNA-146a、TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miRNA-146a、TLR4 mRNA表達(dá)

采用Trizol法分別提取甘全方組、清殘方組、利殘方組、病毒唑組、模型組、正常組細(xì)胞總RNA，將所提取的總RNA用超微量紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)260 nm和280 nm處吸光度（A）值，計(jì)算各組OD260/OD280值，若樣品純度符合實(shí)驗(yàn)要求，則行基因檢測(cè)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒與miRNA-146a、U6、TLR4、β-actin反轉(zhuǎn)錄酶引物，以37 ℃、30 min，65 ℃、10 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min進(jìn)行孵育合成cRNA，-20 ℃保存。采用miRNA-146a、U6、TLR4 mRNA、β-actin的SYBR?Premix Ex Taq進(jìn)行擴(kuò)增，總體系30 μL，分三重復(fù)孔，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)（熒光定量PCR）。采用2-ΔΔCt法，以第一個(gè)樣為1，計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)定量（RQ）值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，進(jìn)行方差分析，若方差齊則組間兩兩比較用t檢驗(yàn)，若方差不齊則用非參數(shù)檢驗(yàn)的Tamhane'sT2法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 病毒毒力測(cè)定結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得出TCID50=10-2.89/mL。

4.2 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)回歸曲線獲得各實(shí)驗(yàn)用藥90%細(xì)胞存活率濃度為甘全方0.003 7 g/mL、清殘方0.002 0 g/mL、利殘方0.008 1 g/mL和病毒唑0.64 mg/mL。

4.3 RNA電泳結(jié)果

6組28 s、18 s RNA的條帶均比較清晰，且28 s RNA均比18 s RNA清晰，見(jiàn)圖1。

4.4 RNA鑒定結(jié)果

各組OD260/OD280在1.8～2.0之間，見(jiàn)表1。表明提取的RNA污染較少，純度較高。

4.5 各組細(xì)胞miR-146a、Toll樣受體 mRNA相對(duì)定量值

miR-146a、U6、TLR4、β-actin的擴(kuò)增曲線、融解曲線見(jiàn)圖2～圖5。從各基因的擴(kuò)增曲線和融解曲線可見(jiàn)，每個(gè)基因擴(kuò)增用的引物特異性強(qiáng)，該基因擴(kuò)增引物進(jìn)行了特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可信。

各組miR-146a mRNA RQ值比較：模型組、病毒唑組較正常組明顯降低（P<0.05），甘全方組、清殘方組、利殘方組均較正常組明顯升高（P<0.05，P<0.01）；甘全方組、清殘方組、利殘方組均較模型組明顯升高（P<0.01），病毒唑組與模型組差異不明顯；清殘方組較甘全方組明顯降低（P<0.05），利殘方組較甘全方組明顯升高（P<0.01），利殘方組較清殘方組明顯升高（P<0.01）；病毒唑組較甘全方組、清殘方組、利殘方組明顯降低（P<0.01）。各組TLR4 mRNA RQ值比較：模型組、甘全方組、清殘方組、病毒唑組較正常組明顯升高（P<0.05，P<0.01），利殘方組與正常組比較無(wú)明顯差異；甘全方組、清殘方組、利殘方組較模型組明顯降低（P<0.01），病毒唑組與模型組比較差異不明顯；清殘方組、利殘方組較甘全方組明顯降低（P<0.01）；清殘方組與利殘方組比較差異不明顯；病毒唑組較甘全方組、清殘方組、利殘方組明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

手足口病患者存在明顯的免疫功能調(diào)節(jié)障礙，T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫球蛋白及補(bǔ)體水平均可能出現(xiàn)異常，同時(shí)患兒細(xì)胞免疫發(fā)育尚不成熟，感染EV71后則更容易進(jìn)展為重癥手足口病，也可能因?yàn)檠装Y因子分泌增多而激發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和膿毒癥，進(jìn)而影響手足口病的轉(zhuǎn)歸，免疫調(diào)控成為治療手足口病的新靶點(diǎn)。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)代謝、免疫、增殖、分化和癌變等多種生物學(xué)過(guò)程，是近年免疫研究的熱點(diǎn)。miR-146是首個(gè)發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)作用的miRNA，包括miR-146a、miR-146b兩個(gè)成員，其中miR-146a在調(diào)節(jié)固有免疫、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如髓系細(xì)胞中miR-146a能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路[7-8]，也可作用于相關(guān)靶基因進(jìn)而調(diào)節(jié)可以抗病毒的干擾素通路[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的途徑之一是下調(diào)Toll樣受體[10-11]，后者能介導(dǎo)炎癥因子的釋放從而啟動(dòng)炎癥應(yīng)答。

我們前期的研究表明，甘露消毒丹及其拆方能直接對(duì)抗病毒[4-5]，那么它們是否可通過(guò)microRNA調(diào)節(jié)機(jī)體免疫？有研究表明，甘露消毒丹具有免疫調(diào)節(jié)作用，能降低濕熱證模型大鼠粒細(xì)胞集落刺激因子水平、增加體內(nèi)一氧化氮的含量，影響血清酶活性等[12-15]，但尚無(wú)其是否能調(diào)控microRNA的報(bào)道。我們的研究結(jié)果顯示，RD細(xì)胞在感染EV71后miR-146a mRNA表達(dá)下降，TLR4 mRNA表達(dá)上升，提示EV71感染導(dǎo)致機(jī)體炎癥與免疫反應(yīng)的機(jī)制之一是抑制miR-146a、上調(diào)TLR4，從而促進(jìn)炎癥因子釋放、啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，甘露消毒丹及其拆方均能以不同程度上調(diào)miR-146a且下調(diào)TLR4 mRNA表達(dá)，推測(cè)它們可能通過(guò)調(diào)控microRNA而調(diào)控炎癥信號(hào)，提示甘露消毒丹及其拆方既能直接抗EV71病毒，也能調(diào)節(jié)EV71感染后的機(jī)體免疫功能，所以甘露消毒丹治療EV71感染的作用是多方面的，這也體現(xiàn)了中醫(yī)復(fù)方多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)特點(diǎn)。而病毒唑?qū)iR-146a、TLR4 mRNA未表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)作用，表明病毒唑主要作用是抗病毒而不能調(diào)節(jié)免疫。

另一方面，拆方研究結(jié)果顯示利殘方的調(diào)節(jié)作用最明顯。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，清殘方抗EV71作用最強(qiáng)而利殘方抗EV71作用最弱[4]，但本研究中利殘方表現(xiàn)出比清殘方更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可見(jiàn)二者側(cè)重點(diǎn)不同，組合成方能使治療更全面，生動(dòng)地展示了中醫(yī)復(fù)方“配伍”的奧妙所在，即在中醫(yī)理論及方劑配伍原則指導(dǎo)下組方，方中每味藥或者藥物組（“功能團(tuán)”）各有所長(zhǎng)、各司其職，共同形成功能全面的整合體，從機(jī)體內(nèi)在紊亂與失衡的多個(gè)“作用點(diǎn)”共同治療疾病。

結(jié)合前期研究結(jié)果，我們還發(fā)現(xiàn)甘全方、清殘方、利殘方均有抗EV71及調(diào)節(jié)miR-146a、TLR4的作用，但甘全方抗EV71的作用較清殘方弱，調(diào)節(jié)miR-146a及TLR4的效應(yīng)又弱于利殘方，這或許表明清殘方及利殘方之間可能存在相互拮抗，只是本實(shí)驗(yàn)尚未對(duì)具體的拮抗機(jī)制作出分析，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將對(duì)這種關(guān)系進(jìn)一步研究，可能有益于揭示中醫(yī)復(fù)方配伍的奧秘。

參考文獻(xiàn)：

[1] WU G Y， ZHU W B， GAO Y X， et al. The risk factors of hand-foot-mouth disease in Chinese mainland people[J]. The Indian Journal of Pediatrics，2014，81（12）：1420-1429.

[2] 高育林.手足口病的中醫(yī)藥治療[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2008，24（10）：15-16.

[3] 尹周安，賀圓圓.手足口病的中醫(yī)防治[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，14（6）：

10-12.

[4] 艾碧琛，賀又舜，趙國(guó)榮，等.甘露消毒丹及其拆方體外抗腸道病毒71型作用[J].中醫(yī)雜志，2014，55（8）：695-698.

[5] 艾碧琛，賀又舜，趙國(guó)榮，等.甘露消毒丹抗腸道病毒71型作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（11）：62-65.

[6] 段富津.方劑學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1995：245-246.

[7] 楊明蘭，顧衛(wèi)瓊.MiR-146與免疫及自身免疫性疾病[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2012，32（2）：165-168.

[8] HOU J， WANG P， LIN L. MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I-dependent type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6， IRAK1， and IRAK2[J]. Journal of Immunol，2009，8，1（3）：2150- 2158.

[9] CAMERON J E， YIN Q Y， FEWELL C， et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces cellular MicroRNA miR-146a， a modulator of lymphocyte signaling pathways[J]. Journal of Virology，2008，82：1946-1958.

[10] WANG J F， YU M L， YU G， et al. Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J]. Biochem Biophys Res Commun，2010，394（1）：184-188.

[11] BHAUMIK D， SCOTT G K， SCHOKRPUR S， et al. Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction of metastatic potential in breast cancer cells[J]. Oncogene，2008， 27（42）：5643-5647.

[12] 徐建瑞，王紅梅，曾琳.甘露消毒丹對(duì)溫病濕熱證模型大鼠血清G-CSF、NO的影響[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（4）：76-77.

[13] 程方平，周潔，陳娟，等.甘露消毒丹對(duì)濕熱證大鼠內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的動(dòng)態(tài)干預(yù)[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，36（4）：43-45.

[14] 程方平，劉松林，楊紅兵，等.甘露消毒丹對(duì)溫病濕熱證大鼠LBP mRNA、CD14 mRNA、NF-κB動(dòng)態(tài)干預(yù)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（4）：56-59.

[15] 曹蓉.甘露消毒丹對(duì)手足口病EV71感染小鼠血清酶活性的影響研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

（收稿日期：2016-07-26）

（修回日期：2016-09-18；編輯：華強(qiáng)）