三元乳癖消凝膠膏質量標準研究

王卓 程玉釧 李媛媛 郭丁丁 倪艷

摘要：目的 建立三元乳癖消凝膠膏的質量標準，增強該制劑的質量可控性。方法 采用薄層色譜法對三元乳癖消凝膠膏中三棱、大皂角、香附和急性子進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定方中延胡索乙素含量。色譜柱：Waters symmetry柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：乙腈∶0.1%磷酸溶液（三乙胺調節pH值至6.4）=55∶45；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm。結果 制劑中三棱、大皂角、香附和急性子的薄層色譜斑點清晰，分離度好；延胡索乙素含量在0.092～1.84 ?g范圍內具有良好的線性關系，平均加樣回收率為100.15%，RSD=1.58%（n=6）。結論 本研究所建立的方法簡便、準確、重復性好，可用于三元乳癖消凝膠膏的質量控制。

關鍵詞：三元乳癖消凝膠膏；急性子；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.019

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）03-0078-04

Study on Quality Standard of Sanyuan Rupixiao Gel Paste WANG Zhuo1， CHENG Yu-chuan1， LI Yuan-yuan1， GUO Ding-ding1， NI Yan1， HAO Xu-liang1， KONG Peng2， YAO Jiao-ni2， LIANG Ze2 （1. Shanxi Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030012， China； 2. Shanxi Fengyuan Pharmaceutical Industry， Ruicheng 044600， China）

Abstract： Objective To establish the quality standard for Sanyuan Rupixiao Gel Paste. Methods Sparganii Rhizoma， Gleditsiae Sinensis Fructus， Cyperi Rhizoma and Impatientis Semen were identified by TLC method. The content of tetrahydropalmatine was determined by HPLC. Waters symmetry column was used with the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphatic acid in a gradient manner （pH was adjusted to 6.4 by triethylamine） （55：45） at the detection wavelength of 280 nm. The flow rate was 1.0 mL/min at the column temperature of 30 ℃. Results The spots in TLC were clear without any interference； tetrahydropalmatine showed a good linear relation in the range of 0.092–1.84 ?g； the average recovery was 100.15% with RSD of 1.58% （n=6）. Conclusion The method is simple and accurate with high reproducibility， which can be used for the quality control of Sanyuan Rupixiao Gel Paste.

Key words： Sanyuan Rupixiao Gel Paste； Impatientis Semen； quality standard； TLC； HPLC

三元乳癖消凝膠膏處方來源于永濟電機廠醫院劉世澤的臨床經驗方，由三棱、大皂角、延胡索、天葵子、香附、急性子等10味藥組成，具有行氣活血、通絡止痛、軟堅散結功效，適用于氣滯血瘀型乳癖，是治療乳腺增生的有效方劑。該制劑具有膏體載藥量大、起效快速、生物利用度高等優勢，特別適合于中藥浸膏制劑[1-3]，然而該制劑目前尚無質量控制標準。為控制本品質量，更好地保證臨床療效，本研究建立三棱、大皂角、香附和急性子的薄層色譜鑒別方法，對君藥延胡索的活性成分延胡索乙素進行含量測定[4-6]，并優化供試品前處理條件，為三元乳癖消凝

基金項目：山西省科技重大專項研究項目（20121101014）

通訊作者：郝旭亮，E-mail：hxliang-01@163.com

膠膏制訂準確可靠的質量控制標準。

1 儀器與試藥

MS101-1型電熱恒溫干燥箱（上海市松江縣楓涇機電廠），939型薄層制板器（重慶南岸貝爾德儀器技術廠），UV-8型三用紫外分析儀（上海分析儀器廠無錫分廠），BP211D型電子天平（德國Startorius），薄層色譜用硅膠G、GF254、H（青島海洋化工有限公司）。美國戴安U3000高效液相色譜儀；VWD-3X00紫外檢測器；Waters symmetry色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

三棱對照藥材（批號121521-201103）、大皂角對照藥材（批號121611-201001）、急性子對照藥材（批號121606-201001）、α-香附酮對照品（批號110748- 200507）、延胡索乙素對照品（供含量測定用，批號110726-201011，純度以99.9%計），中國食品藥品檢定研究院；三元乳癖消凝膠膏（批號20131001、20140501、20140502、20140503）及缺味藥材陰性凝膠膏，山西豐源藥業有限公司。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 三棱 取本品2片，剪碎，除去蓋襯，加乙醇60 mL，加熱回流1 h[3]13，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解并轉移至分液漏斗，加二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取三棱對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。另取缺三棱的陰性樣品，同法制成三棱陰性對照溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 ?L、對照藥材溶液5 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-丙酮（5∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.2 大皂角 取本品2片，剪碎，除去蓋襯，加甲醇60 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL，轉移至分液漏斗，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解[3]21，過中性氧化鋁柱（100～200目，3 g，內徑2 cm）上，以甲醇洗脫至無色，棄去甲醇溶液，再用85%甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取大皂角對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。另取缺大皂角的陰性樣品，同法制成大皂角陰性對照溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 ?L、對照藥材溶液5 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸（16∶1∶0.6∶0.2）的下層溶液為展開劑，飽和1 h，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.3 香附 取本品2片，剪碎，除去蓋襯，置具塞錐形瓶中，加石油醚50 mL，密塞，搖勻，浸漬1 h，時時振搖，過濾，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取α-香附酮對照品，加乙酸乙酯制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液[3]258。另取缺香附的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成香附陰性對照溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 ?l、α-香附酮對照品溶液2/3 ?L，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（60∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（254 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1.4 急性子 取本品2片，剪碎，除去蓋襯，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，過濾，取續濾液，即得供試品溶液。取急性子對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。另取缺急性子陰性樣品，同法制成急性子陰性對照溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10 ?L，分別點于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-乙醇（20∶1）為展開劑[4]，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）延胡索項下延胡索乙素含量測定方法及文獻[5-6]，經調整完善后確定。色譜柱：Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：乙腈∶0.1%磷酸溶液（三乙胺調pH值至6.4）=55∶45；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃。理論塔板數按延胡索乙素峰計算應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成92 ?g/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，剪碎，混勻，取約10 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入2%鹽酸水溶液150 mL，密塞，稱定質量，浸潤過夜，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）90 min，放冷，再稱定質量，用2%鹽酸水溶液補足減失的質量，過濾，取續濾液。將續濾液低溫（≤60 ℃）濃縮至30 mL，加濃氨調節pH值至9.5±0.2，用甲苯振搖提取4次，每次30 mL，合并甲苯提取液，低溫水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺延胡索藥材的陰性凝膠膏，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 將對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液分別進樣10 ?L，依法測定，結果供試品溶液中待測成分色譜峰與延胡索乙素對照品色譜峰保留時間一致，陰性對照溶液無干擾，表明本方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

2.2.6 線性關系考察 精密稱取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1 mL含92 ?g的溶液。分別精密吸取1、2、5、10、15、20 ?L進樣，依法測定，以延胡索乙素含量（?g）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程Y=10.297X+0.001 6，r=1。表明延胡索乙素進樣量在0.092～1.84 ?g范圍內具有良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取同一對照品溶液（92 ?g/mL），按上述色譜條件連續進樣6次，每次10 ?L測定，計算延胡索乙素峰面積積分值RSD=0.17%，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，每隔2.5 h測定1次，共進樣5次，結果延胡索乙素峰面積RSD=0.69%，表明供試品溶液中延胡索乙素含量在10 h內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取同一批三元乳癖消凝膠膏（批號20131001），按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。結果延胡索乙素的平均含量為39.78 ?g/g，RSD=1.58%，表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知延胡索乙素含量的同一批三元乳癖消凝膠膏樣品（批號20131001）6份，每份約5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 取三元乳癖消凝膠膏3批樣品（批號20140501、20140502、20140503）中延胡索乙素含量進行測定。按供試品溶液的制備方法操作，精密吸取供試品溶液10 ?L，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，計算樣品中延胡索乙素的含量，結果見表2。

3 討論

三元乳癖消凝膠膏因其處方藥味較多，加之藥用輔料凝膠基質的存在，故易造成供試品與對照藥材相應位置斑點重疊、斑點顏色不一致等，難以達到鑒別效果，且大皂角、香附和急性子在復方制劑中的薄層鑒別方法報道很少。在預試驗中，筆者曾參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）對大皂角、香附和急性子進行薄層色譜鑒別，因其背景及基質影響嚴重，且急性子陰性存在干擾。經多次試驗，大皂角采用中性氧化鋁柱進行純化后干擾消失，斑點顯現；香附將乙醚改用石油醚作為提取溶劑較藥典方法（乙醚），背景色明顯變淺，斑點清晰；急性子改用乙醇直接超聲提取，層析用板由硅膠G薄層板改用硅膠H后，陰性干擾消除，同時操作簡單快速，方法穩定，層析效果理想，可作為急性子薄層鑒別的常用方法；此外，環境相對濕度對三棱的薄層色譜行為有較大影響，故宜快速點樣，若空氣濕度較大，可在雙槽展開缸展開劑的另一側加入適量濃硫酸。

在對延胡索乙素含量進行測定時，由于凝膠基質的干擾、藥材之間的相互影響，以及延胡索乙素的熱不穩定性，本研究對供試品溶液的制備方法進行了優化，選擇超聲提取方法，并考察了不同提取溶劑（甲醇、2%鹽酸水溶液、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮）及其用量（100、150、200 mL）對檢測樣品的影響，結果選擇2%鹽酸水溶液150 mL時有效成分延胡索乙素的提取率最高；另外，由于本品凝膠基質的影響，超聲濃縮后溶液較為黏稠，所以采用不同極性的有機試劑（石油醚、甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷）對超聲溶液進行萃取，最終選定甲苯作為萃取溶劑，萃取4次，即可達到檢測要求。

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（收稿日期：2016-05-17）

（修回日期：2016-06-06；編輯：陳靜）